Utilisation de la biologie synthétique à l'ingénieur cellules vivantes Interface avec les matériaux programmables
Summary
Ce document présente une série de protocoles pour le développement de cellules modifiées et des surfaces fonctionnalisés qui permettent synthétiquement par génie E. coli pour contrôler et manipuler les surfaces des matériaux programmables.
Abstract
Nous avons développé une interface abiotiques-biotiques qui permet aux cellules d'ingénierie pour contrôler les propriétés du matériau d'une surface fonctionnalisée. Ce système est réalisé par la création de deux modules: une souche synthétiquement modifié génétiquement de cellules de E. coli et une interface de matériau fonctionnalisé. Dans cet article, nous détaillons un protocole pour l' ingénierie génétique des comportements sélectionnés au sein d' une souche de E. coli en utilisant des stratégies de clonage moléculaire. Une fois développée, cette souche produit des niveaux élevés de la biotine lorsqu'il est exposé à un inducteur chimique. De plus, nous protocoles de détail pour la création de deux différentes surfaces fonctionnalisés, dont chacun est en mesure de répondre à la biotine synthétisé cellulaire. Pris ensemble, nous présentons une méthodologie pour la création d'un système abiotiques-biotiques lié qui permet aux cellules de contrôle de la composition des matériaux et de l'assemblage sur des substrats inanimés conçu.
Introduction
Ici, nous rapportons les procédures pour l'élaboration d'un substrat programmable apte à répondre à un signal chimique à partir d'une lignée cellulaire d'ingénierie. 1 Nous faisons cela en créant une interface de biotine-streptavidine qui répond à la biotine produite par Escherichia coli synthétiquement ingénierie (E. coli) des cellules. Auparavant, les surfaces programmables ont été conçus pour une large gamme d'applications de détection de la toxine 2 et le point-of-care diagnostic 3 à la défense et à la sécurité. 4 Alors que les surfaces programmables peuvent être utiles en tant que capteurs et actionneurs, ils peuvent être plus «intelligents» en les dotant de la capacité d'adaptation aux différents défis environnementaux. En revanche, même les micro – organismes simples, tels que E. coli, ont adaptabilité inhérente et sont capables de répondre aux problèmes des solutions complexes et souvent inattendues. Cette capacité d' adaptation a permis E.coli, les populations contrôlées par leurs réseaux de gènes complexes, de manière rentable d'obtenir des ressources, 5 créer des produits à valeur ajoutée, 6 et même puissance robotique micro-échelle. 7 En couplant les avantages adaptatifs de cellules vivantes avec l'utilisation de surfaces programmables, nous pouvons créer un substrat intelligent capable de répondre à différentes conditions environnementales.
La biologie synthétique a permis aux chercheurs de nouvelles capacités pour programmer le comportement des organismes vivants. En orchestrant les cellules pour contenir les réseaux de régulation nouveaux gènes, les chercheurs peuvent concevoir des cellules qui présentent une gamme de comportements programmés. 8, 9 Au – delà de la recherche fondamentale, ces comportements peuvent être utilisés pour des applications telles que le contrôle de l' assemblage des matériaux et la production biologique des produits à valeur ajoutée. 10 Ici, nous détaillons comment nous avons utilisé les outils de la biologie synthétique engineer une souche de E. coli qui synthétise la biotine lors de l' induction. Cette souche a été développée en utilisant des méthodes d'enzyme de restriction de clonage pour assembler un plasmide, pKE1-lad-bioB. Ce plasmide, lorsqu'il est transformé dans la souche E. coli K-12 MG1655, lui confère des cellules ayant la capacité d'exprimer des niveaux élevés de bioB, une enzyme essentielle pour la synthèse de la biotine. Lorsque les cellules transformées ont été induites avec de l'isopropyl β-D-thiogalactopyranoside 1 (IPTG) et muni d'un précurseur de la biotine, de la desthiobiotine (BTD), des taux élevés de biotine ont été produites.
l'interaction de liaison de biotine avec la streptavidine est l'une des plus fortes liaisons non covalentes trouvés dans la nature. A ce titre, l'interaction biotine-streptavidine est à la fois bien caractérisés et très utilisés dans la biotechnologie. 11 Dans ce manuscrit, nous présentons deux stratégies utilisant l'interaction biotine-streptavidine à détecter et à détecter la biotine produite cellulaire avec une surface fonctionnalisée. nousse référer à ces surfaces contrastées que les systèmes de contrôle "directs" "indirects" et. Dans le schéma de contrôle indirect, la biotine produite cellulaire est en concurrence avec la biotine qui a été conjugué et immobilisé sur une surface de polystyrène pour les sites de liaison streptavidine. En outre, la streptavidine est conjuguée à la peroxydase de raifort (HRP). HRP modifie 3, 3 ', 5, 5'-tétraméthylbenzidine (TMB), pour produire un signal optique, qui peut être 12 surveillée par la quantification de l'absorption spectrale ( par exemple, une densité optique) à 450 nm (DO 450). Ainsi, le système de contrôle indirect permet aux chercheurs de mesurer la biotine produite cellulaire en surveillant la attentuation du signal OD 450.
Le système de contrôle direct exploite l'événement streptavidine-biotine en immobilisant streptavidine directement à une surface du matériau et permettant la biotine produite cellulaire et HRP biotinylé à concourir pour les sites de liaison streptavidine. Encore une fois, lales niveaux relatifs de la biotine produite cellulaire sont surveillées en mesurant un signal OD 450.
Pris ensemble, les cellules modifiées et des surfaces fonctionnalisés nous permettent de contrôler les propriétés d'une surface programmable en induisant des réseaux dans les cellules vivantes. En d'autres termes, nous avons créé un système qui tire parti de la capacité d'adaptation des organismes vivants et la fiabilité et la spécification d'une interface de matériel d'ingénierie en reliant ces systèmes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons présenté une nouvelle stratégie pour l'interfaçage des cellules modifiées vivant avec une surface de matériau fonctionnalisé. Ceci a été accompli en mettant au point une lignée de cellules capables de synthétiser des taux élevés de la biotine lors de l'induction avec de l'IPTG. Les niveaux élevés de biotine peuvent ensuite être utilisés pour modifier la surface fonctionnalisée. Les protocoles détaillés comment ingénieur de la lignée cellulaire E. coli et comment cré…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le soutien de l'attribution FA9550-13-1-0108 de l'Air Force Office de la recherche scientifique des Etats-Unis. Les auteurs reconnaissent en outre le soutien de l'attribution N00014-15-1-2502 de l'Office of Naval Research des Etats-Unis, le financement de l'Institut de technologie de critique et de sciences appliquées à Virginia Polytechnic Institute et l'Université d'Etat, et de la National Science Foundation Graduate Research Programme de bourses, le numéro d'attribution 1607310.
Materials
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| M9, Minimimal Salts, 5X | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Casamino Acids | Fisher Scientific | BP1424-100 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| NEB Turbo Cell Line | New England Biolabs | C2984l | |
| Oligonucleotide Primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | 25N synthesis, DSL purification |
| Q5 High-Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| Q5 Reaction Buffer | New England Biolabs | B9027S | |
| dNTP Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | |
| Agarose | Bioexpress | E-3120-125 | |
| Ethidium Bromide, 1% | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| Gel Extraction Kits | Epoch Biolabs | 2260250 | |
| GenCatch Plasmid DNA Miniprep Kit | Epoch Biolabs | 2160250 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104S | |
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101S | |
| Cutsmart Buffer | New England Biolabs | B7204S | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| ColiRolle Glass Plating Beads | EMD Millipore | 7101-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| NHS-Desthiobiotin (DTB) | Thermo Fisher Scientific | 16129 | |
| Succinimidyl Trans-4-(maleimidylmethyl) Cyclohexane-1-Carboxylate (SMCC) | Thermo Fisher Scientific | S1534 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) Propionate (SPDP) | Thermo Fisher Scientific | S1531 | |
| NHS-LC-LC-biotin | Thermo Fisher Scientific | 21343 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) | Thermo Fisher Scientific | 31490 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X Solution | Fisher Scientific | BP399500 | |
| Streptavidin (SA) | Thermo Fisher Scientific | 21145 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Ethylenediaminetetaacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-500 | |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-4 | |
| 3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine (TMB) | Fisher Scientific | AC229280050 | |
| Vivaspin 500 Centrifugal Concentrators | Viva Products | VS0192 | |
| Sodium Acetate, Anhydrous | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| 96-Well Polystyrene Plates | Thermo Fisher Scientific | 266120 |
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