Evaluatie van intracellulaire locatie van reactieve zuurstof soorten in Solea Senegalensis Spermatozoa
Summary
Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methodologie voor het opsporen van H2O2 localisatie binnen Solea senegalensis spermacellen met behulp van een gevoelige fluorescerende DCFH-DA ROS, een levende mitochondriën vlek voor mitochondria en DAPI voor kernen visualisatie, respectievelijk. Het protocol is ontworpen om te worden uitgevoerd binnen de 2 uur met verse of ontdooide spermacellen.
Abstract
Oxidatieve stress is één van de belangrijkste factoren in het verminderen van de kwaliteit van het sperma. Het ontwikkelen van efficiënte protocollen voor het opsporen van reactieve zuurstof soorten (ROS) in spermacellen is van groot belang in alle soorten, maar deze methoden zijn zelden gebruikte en nog minder in teleost. Cryopreservatie is een nuttige techniek in de aquacultuur voor verschillende doeleinden, met inbegrip van gene bancaire en gegarandeerde sperma beschikbaarheid gedurende het hele jaar. Invriezen/ontdooien procedures kunnen veroorzaken ROS productie en schadelijk voor de zaadcellen. Gezien de potentiële die schade zou kunnen een overmaat van ROS productie veroorzaken bij spermacellen afhankelijk van hun lokalisatie, hier een gedetailleerde methodologie te detecteren H2O2 en te evalueren van de intracellulaire lokalisatie door confocale microscopie wordt verstrekt. Voor dit doel, een combinatie van 3 fluorochromes (2′, 7-Dichlorodihydrofluorescein DIACETAAT (DCFH-DA), een live mitochondriën vlek en 4 ‘, 6-Diamidino-2-phenylindole-dihydrochloride (DAPI)) worden gebruikt om te evalueren van de co lokalisatie van H2O2 met spermacellen kernen of mitochondriën in Solea senegalesis spermastaaltje.
Introduction
De productie van reactieve zuurstof soorten is in verband gebracht met de kwaliteit van het sperma onlangs1. Hoewel ROS productie in mitochondriën kan worden beschouwd als een normale fysiologische proces, is oxidatieve stress door een overmaat aan ROS productie een duidelijke oorzaak van de schade in spermacellen op verschillende niveaus. Bij de mens wordt oxidatieve stress geassocieerd met mannelijke infertiliteit, wijzigen van de beweeglijkheid en de mogelijkheid om het ondergaan van de rechtsbevoegdheid2; bij zoogdieren, heeft verandering van DNA integriteit in ingevroren sperma monsters ook verband met de synthese van H2O23.
Cryopreservatie is een gemeenschappelijke techniek voor gen bankbedrijf in de aquacultuur. Deze technologie is met name belangrijk in soorten met vruchtbaarheidsproblemen zoals Solea senegalensis. Deze waardevolle soorten op de markt toont reproductieve dysfunctie in individuen geboren in gevangenschap als gevolg van een gebrek aan verkering. Dit feit maakt sperma cryopreservatie noodzakelijk dat sperma beschikbaarheid voor kunstmatige bevruchting. Cryopreservatie zou echter een bron van oxidatieve stress die schadelijk voor spermacellen4 zou kunnen zijn, zoals studies hebben een gunstig effect van antioxidant suppletie gemeld. ROS remming door middel van mitochondriale-gerichte antioxidant was naar verluidt gunstig voor sperma cryopreservatie in gele meerval5.
De niveaus van ROS in spermastaaltje zijn daarom belangrijk om te weten, vooral na cryopreservatie6,7 , omdat deze moleculen zijn erkend als een nadeel voor zaadcellen overleven en vruchtbaarheid8. Bovendien, het bestuderen van de verdeling van de ROS binnen de cel kan doorslaggevend zijn voor afleiden van het niveau van de potentiële schade. Als voorbeeld, lage niveaus van ROS in de mitochondriën kunnen worden aangenomen, normale en compatibel met sperma functie, maar hoge niveaus van ROS binnen de kern zou indicatoren van de schade van DNA van spermacellen. H2O2 is een van de meest relevante ROS die kunnen vrijkomen uit de mitochondriën en het doordringen van de kern, want het is een kleine en lading-minder molecuul9. Dichlorofluorescein DIACETAAT (DCFH-DA) kan specifiek intracellulaire peroxide uitstoten groene fluorescentie onthullen. In dit artikel wordt een gedetailleerd protocol voor het opsporen van H2O2 intracellulaire lokalisatie in Solea senegalensis sperma met behulp van de confocal microscopie gepresenteerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het is algemeen bekend dat mitochondriën belangrijke organellen voor de beweeglijkheid van de zaadcellen en functie zijn. Deze organellen zijn gelijktijdig direct betrokken bij de productie van ROS. Interessant, zijn gecontroleerde niveaus van ROS nodig voor goede zaadcellen functie1. Positieve relaties tussen vruchtbaarheid en oxidatieve stress zijn aangetoond in zoogdieren11 maar buitensporige niveaus beïnvloeden sperma kwaliteit12. Een cruciale …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken AQUAGAMETE FA 1205 COST Action. Dit werk werd financieel ondersteund door AGL201568330 + C2 + 1 + R project (MINECO/FEDER). David G. Valcarce werd gefinancierd door de Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) en Fondo sociale Europeo. Auteurs erkennen Dr. Ana Riaza en Stolt Sea Farm S.A., Dr. Paulino de Paz, Dr. Ignacio Martínez Montero en José Ramón Guiérrez. Wij danken ook Paula Fernández Colado voor videografie.
Materials
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
- Amaral, S., et al. Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function. Curr Med Chem. , (2016).
- Morielli, T., O’Flaherty, C. Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa. Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. , (2016).
- Zhu, Z., et al. Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action. PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).
- Fang, L., et al. Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish. Cryobiology. 69 (3), (2014).
- Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis. Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).
- Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm. Theriogenology. 73 (3), (2010).
- Guthrie, H. D., Welch, G. R. Effects of reactive oxygen species on sperm function. Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).
- Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. Reactive oxygen species and sperm function–in sickness and in health. J Androl. 33 (6), (2012).
- Valcarce, D. G., Robles, V. Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa. Reproduction. 152 (5), (2016).
- Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress. Biol Reprod. 91 (3), (2014).
- Cabrita, E., et al. Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis. Aquaculture. 432, 389-401 (2014).
