Summary
Questo protocollo descrive una dettagliata metodologia per la rilevazione di localizzazione di H2O2 all'interno di spermatozoi, Solea senegalensis utilizzando un fluorocromo sensibile DCFH-DA ROS, una macchia di mitocondri dal vivo per i mitocondri, e DAPI per nuclei visualizzazione, rispettivamente. Il protocollo è progettato per essere eseguito all'interno di 2 h con gli spermatozoi o freschi o scongelati.
Abstract
Lo stress ossidativo è uno dei fattori importanti nel fare diminuire la qualità dello sperma. Lo sviluppo di efficienti protocolli per la rilevazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) degli spermatozoi è di grande importanza in tutte le specie, ma questi metodi sono utilizzati raramente e ancor meno nel teleosteo. Crioconservazione è una tecnica utile in acquacoltura per scopi diversi, comprese le operazioni di gene e garantita disponibilità di sperma durante tutto l'anno. Procedure di congelamento/scongelamento potrebbe causare la produzione di ROS e danneggiare le cellule dello sperma. Considerando i potenziali danni che un eccesso di produzione di ROS potrebbe causare degli spermatozoi a seconda della loro localizzazione, qui una dettagliata metodologia per rilevare H2O2 e per valutare la localizzazione intracellulare mediante microscopia confocale è fornito. Per questo scopo, una combinazione di 3 fluorocromi (2 ′, 7 ′-Dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCFH-DA), una macchia di mitocondri dal vivo e 4 ′, 6-Diamidino-2-phenylindole dicloridrato (DAPI)) vengono utilizzati per valutare la co-localizzazione di H2O2 con nuclei di spermatozoi o mitocondri nei campioni di sperma di Solea senegalesis .
Introduction
La produzione di specie reattive dell'ossigeno è stata collegata con la qualità dello sperma di recente1. Anche se la produzione di ROS nei mitocondri può essere considerata un normale processo fisiologico, lo sforzo ossidativo da un eccesso di produzione di ROS è una chiara causa di danno negli spermatozoi a diversi livelli. In esseri umani, lo sforzo ossidativo è associato con infertilità maschile, alterando la motilità e la capacità di subire capacitazione2; nei mammiferi, cambiamento dell'integrità del DNA nei campioni di seme congelato è stata anche collegata alla sintesi di H2O23.
Crioconservazione è una tecnica comune per gene bancaria in acquacoltura. Questa tecnologia è particolarmente importante nelle specie con problemi riproduttivi quali Solea senegalensis. Questa specie di valore nel mercato mostra disfunzione riproduttiva in individui nati in cattività a causa della mancanza di corteggiamento. Questo fatto rende necessario avere disponibilità di spermatozoi per la fecondazione artificiale crioconservazione degli spermatozoi. Tuttavia, la crioconservazione potrebbe essere una fonte di stress ossidativo che potrebbe essere dannoso per gli spermatozoi4 come studi hanno segnalato un effetto benefico del completamento antiossidante. Inibizione di ROS attraverso antiossidante mitocondriale-mirato è stato riferito di essere benefico per la crioconservazione di spermatozoi in pesce gatto giallo5.
Di conseguenza, i livelli di ROS nei campioni di sperma sono importanti per sapere, in particolare dopo crioconservazione6,7 perché queste molecole sono state riconosciute come uno svantaggio per la sopravvivenza dello sperma e fertilità8. Inoltre, studiando la distribuzione dei ROS all'interno della cellula potrebbe essere cruciale per dedurre il livello di danno potenziale. Ad esempio, i bassi livelli di ROS nei mitocondri potrebbero essere presupposto normale e compatibile con la funzione dello sperma, ma alti livelli di ROS all'interno del nucleo potrebbero essere indicatori di danno del DNA degli spermatozoi. H2O2 è uno dei più rilevanti ROS che potrebbe essere rilasciato dai mitocondri e penetrare nel nucleo, perché si tratta di una molecola piccola e carica-meno9. Diclorofluoresceina diacetato (DCFH-DA) può rivelare specificamente perossido intracellulare che emette fluorescenza verde. In questo articolo, è presentato un protocollo dettagliato per individuare la localizzazione intracellulare di H2O2 nel Solea senegalensis sperma usando la microscopia confocal.
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Protocol
Nota: Fluorocromo incubazione e analisi confocale richiederà almeno 2-3 h per un controllo e un campione non trattato. Elaborazione dei dati non è incluso in questo calcolo di tempo. Materiali richiesti possono essere trovati nella Tabella materiali. Questo protocollo può essere applicato a spermatozoi freschi o crioconservati. Solea senegalensis è una specie di pesce che depone le uova in acqua fredda, lavoro sempre in condizioni di freddo (4-7 ° C). Vedere la Figura 1 per una visione generale del protocollo.
1. preparativi prima dell'esperimento
- Preparare un 1mm mitocondri macchia soluzione stock in grado analitico DMSO.
- Preparare un 4 ′ 1 μg/mL, soluzione di riserva 6-diamidino-2-phenylindole dicloridrato (DAPI) in acqua deionizzata.
- Preparare una soluzione di Ringer mOsm/kg 200 (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7,7)
- Preparare un 4mm 2 ′, 7 ′-dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCFH-DA) soluzione in metanolo di purezza analitica.
Nota: Mantenere le soluzioni stock in aliquote a-20 ° C fino a quando necessario. - Impostare microcentrifuga a 4-7 ° C.
2. preparazione del campione prima dell'incubazione fluorocromo
Nota: Manipolazione delicata degli spermatozoi è auspicabile quando pipettaggio e risospendere.
- Se lavora con cellule crioconservate, preparare un bagno di acqua per lo scongelamento a 40 ° C per Solea senegalensis spermatozoi10. Immergere i campioni della paglia nel bagno d'acqua per 7 s.
- Utilizzando le forbici per tagliare, svuotare il campione in una provetta di microfuge e centrifugare a 1000 x g, 4-7 ° C per 1 min.
- Rimuovere il plasma seminale o plasma seminale con crioprotettori dall'esempio crioconservato pipettando per scartare qualsiasi componente che potrebbe interferire con il protocollo di colorazione.
- Risospendere le cellule in 50-100 μL di 4 ° C 200 mOsm/kg soluzione Ringer.
- Determinare la concentrazione di spermatozoi con una Neubauer o una camera simile conteggio al microscopio stereoscopico.
- Diluire la sospensione cellulare fino a 1-2 x 106 cellule/mL in un volume finale di 0.5 mL a 4 ° C soluzione Ringer.
3. fluorocromo incubazione
Nota: Fluorocromi devono essere gestiti in condizioni di scarsa luminosità, specialmente quando in soluzione.
- Aggiungere 3.125 μL di soluzione di riserva di DCFH-DA (concentrazione finale nel campione: 25 μM) per la diluizione del campione di lavoro. Incubare a 4-7 ° C per 40 min in tenebre10.
- Dopo 30 min, aggiungere 0,5 μL della soluzione madre DAPI (concentrazione finale del campione: 2 μM) e 0,5 μL dei mitocondri macchia soluzione madre (concentrazione finale del campione: 100 nM) al campione. Incubare entrambi fluorocromi per 10 min al buio.
4. preparazione dei campioni per microscopia confocale
- Dopo il tempo di incubazione, centrifugare la sospensione cellulare a 1000 x g, 4-7 ° C per 1 min.
- Scartare il surnatante attentamente pipettando.
- Aggiungere un 10-20 μL di soluzione Ringer 200 mOsm/kg.
- Posto 5 μL di sospensione concentrata di cellule drop su una diapositiva.
- Attentamente, mettere un vetrino sulla preparazione e sigillare con smalto. Una volta che lo smalto è asciutto, la preparazione è pronta per microscopia confocale.
5. confocale installazione prima dell'esperimento
Nota: A seconda del microscopio, DCFH-DA potrebbe essere "bruciato". Stabilire le migliori condizioni con un campione di non-preziosa prima.
- Accendere il microscopio, laser, macchina fotografica e il computer che esegue il microscopio.
- Impostato il laser di eccitazione prendendo in considerazione i valori massimi di eccitazione e di emissione di ogni fluorocromo:
- Per DAPI, utilizzare un massimo di eccitazione di 358 nm e un massimo di emissione di 465 nm.
- Per la macchia mitocondriale, utilizzare un massimo di eccitazione di 644 nm e un massimo di emissione di 662 nm.
- Per DCFH-DA, utilizzare un massimo di eccitazione di 504 nm e un massimo di emissione di 525 nm.
- Iniziare a lavorare con un obiettivo 25 X mettere a fuoco gli spermatozoi. Scegliere il canale DAPI a fuoco perché questo fluorocromo segnala l'intensità più alta. Una volta che le cellule sono concentrate, utilizzare un 63 X o obiettivo 100x per una valutazione approfondita perché Solea senegalensis spermatozoi dimensione è circa 2 μm.
- Per ogni canale, ottimizzare il foro stenopeico, il guadagno e la tensione. Allo stesso modo, regolare l'offset digitale per ridurre la priorità bassa. Una volta che tutti i parametri sono ottimizzati per il fluorocromo utilizzato, è possibile salvare le impostazioni. Per un esperimento di routine per un singolo spermatozoo di Solea senegalensis abbiamo utilizzato i seguenti (questi parametri possono cambiare in ogni esperimento): pinhole 1 e la tensione di guadagno di 750 V.
6. acquisizione di immagini
- Selezionare le condizioni di qualità desiderata per l'acquisizione dell'immagine. Definire le impostazioni di acquisizione come profondità di bit, formato immagine, foglio leggero spessore e scegliere singola illuminazione bifacciale. Per un esperimento di routine per un singolo Solea senegalensis spermatozoi abbiamo utilizzato i seguenti (questi parametri possono cambiare in ogni esperimento): dimensione di 1024 px; bit per pixel di 16; velocità di scansione di 2-4).
- Aprire e centrare l'area di scansione per iniziare e prendere un'immagine del campo.
- Con lo strumento taglierina, selezionare la regione di interesse e premere dal vivo.
- Con l'aiuto dello strumento indicatore gamma, regolare l'offset digitale per ridurre lo sfondo. Fate questo per ogni canale e prendere l'immagine.
- Controllare la qualità dei singoli canali per ogni fluorocromo e loro combinazioni.
7. creazione di un'immagine 3D Video
- Impostazioni di acquisizione di Z-stack.
- Scegliere l'opzione Z-stack nel software.
- Selezionare la cella singola, gruppo di cellule o regione di interesse e mettere a fuoco.
- Delimitare lo Z-stack con le opzioni 'Prima fetta' e 'Ultima fetta' e stabilire il passo di z all'intervallo a 0,2 µm con l'aiuto della messa a fuoco fine. Scegliere il canale DAPI a fuoco perché questo fluorocromo potrebbe segnalare la massima intensità e si può facilmente selezionare tutta la testa degli spermatozoi. Scegliere i parametri di acquisizione ottimale per ogni canale ed eseguire l'esperimento.
- Eseguire l'esperimento di Z-stack. Dividere i canali e osservare la localizzazione di ciascun segnale all'interno delle cellule.
- Processo di Z-stack.
- Rendering di volume: una volta che l'esperimento è terminato, selezionare le opzioni del software di elaborazione dello stack Z e scegliere il volume render opzione. Selezionare il numero di passaggi e i gradi di rotazione (360°). Salvare il file con estensione dei video.
- Stereo anaglifi: scegliere anaglifi stereo nelle opzioni finestra di processo. Questo strumento permette di creare un'immagine 3D dei video con canali split.
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Representative Results
La microscopia confocale è un metodo ideale per la valutazione di ROS intracellulari in teleostei sperma. La combinazione dei tre fluorocromi (DAPI, una macchia di mitocondri e DCFH-DA) presentati in questo studio (Figura 1) fornisce molte informazioni utili che possono essere applicati nella ricerca di base e possono avere applicazioni nel migliorare le procedure utilizzate in impianti di acquacoltura industriale, quali i protocolli di crioconservazione. Diversi tipi di analisi possono essere effettuati al fine di correlare la presenza ROS intracellulare e altri parametri: motilità, vitalità, diversi modelli tra buoni e cattivi allevatori, attivazione di motilità o variazioni stagionali sperma tra molti altri. Nel presente lavoro, vengono visualizzati due diversi modelli di distribuzione intracellulare di H2O2 all'interno degli spermatozoi: collocato con mitocondrio o diffusione nel nucleo (figure 2, 3). Tali spermatozoi risultati basso potenziale danno prodotto da ROS ha mostrato DCFH-DA etichettatura solo nei mitocondri, mentre quelli che soffrono di danni del DNA ha mostrato DCFH-DA etichettatura anche nei nuclei. Microscopia confocale software permette di creare video utili e fornire grafici di colocalizzazione di facile e veloce.
Figura 1 . Panoramica generale del protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Esempio di acquisizione di immagini confocal. R. schema dell'esempio B. Canale DAPI (etichettatura dsDNA). C. i mitocondri macchiano canale (etichettatura mitocondrio). D. Mitocondri macchiano canale fuse con canale di DAPI. E. canale DCFA-DH (etichettatura intracellulare H2O2). F. canale DCFA-DH fuse con canale di DAPI. G. Merge dei tre canali. Abbreviazioni: n: nuclei, mt: mitocondri, f: flagello e mb: membrana. Barra della scala: 5 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Diversi modelli di intracellulare H2O2 in Solea senegalensis spermatozoi (rendering di Volume). Canali risultante degli spermatozoi risultati ROS intracellulari nel fossa nucleare e nel mitocondrio (A, C, E). Canali risultante degli spermatozoi risultati intracellulari H2O2 anche all'interno dei nuclei (B, D, F). A e B: DAPI. C e D: DCFH-procuratore. E e F: mitocondri macchia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
È noto che i mitocondri sono organelli chiavi per motilità dello sperma e la funzione. Questi organelli sono contemporaneamente direttamente coinvolti nella produzione di ROS. È interessante notare che, controllati i livelli di ROS sono necessari per lo sperma corretta funzione1. Relazioni positive tra fertilità e stress ossidativo sono state indicate in mammiferi11 ma livelli eccessivi influenzano sperma qualità12. Un fattore cruciale che potrebbe essere decisivo verso un effetto positivo o negativo è non solo i livelli di ROS, ma anche localizzazione intracellulare di ROS. Uno degli effetti deleteri del ROS sta producendo DNA danni9 e pertanto la presenza nucleare di ROS potrebbe essere un indicatore di danno potenziale nel nucleo mentre i livelli di ROS potrebbero essere normali in mitocondri. È necessario integrare i metodi quantitativi esistenti (ad es., citometria a flusso) con tecniche come la microscopia confocale che potrebbe fornire informazioni sulla localizzazione intracellulare di ROS.
La microscopia confocale è un'opzione ottimale per visualizzare la localizzazione intracellulare di ROS. L'uso di specifici fluorocromi come una macchia di mitocondri dal vivo e DAPI permette la visualizzazione dei mitocondri e nucleo rispettivamente e la combinazione di queste molecole con DCFH-DA permette la localizzazione intracellulare di perossido.
Fluorocromo incubazione e confocale installazione sono i punti critici all'interno del protocollo. Entrambi i passaggi devono essere ottimizzati ed eseguiti con cura per ottenere risultati riproducibili e coerenti. Metodologia le modifiche devono essere eseguite a questi due livelli a seconda del plasma seminale utilizzato. Di conseguenza, incubazione fluorocromo dovrebbe essere adattato. Le temperature e le condizioni di conservazione differiscono significativamente tra i campioni di sperma, e la maggior parte dei protocolli sono ottimizzati per i mammiferi.
Qui, un protocollo per i campioni di sperma Teleostei, particolarmente per gli spermatozoi di Solea senegalensis , è descritto (Figura 1). Successo di etichettatura dei nuclei e i mitocondri sono stati effettuati utilizzando il protocollo descritto e presenza ROS è stato rivelare utilizzando DCFH-DA (Figura 2). I risultati indicano che co-localizzazione di H2O2 sono stati trovati nei nuclei o mitocondri a seconda del campione di sperma (Figura 3). Come precedentemente spiegato, quei campioni con un'alta percentuale di spermatozoi visualizzati da elevati livelli di ROS all'interno del nucleo sarebbe incline a danni del DNA. Questo protocollo ha un'unica limitazione, il requisito dell'apparecchiatura costosa (microscopio confocale), ma potrebbe avere utilità futura nella selezione dei campioni di sperma con bassa presenza di ROS all'interno del nucleo per scopi di crioconservazione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo AQUAGAMETE FA 1205 COST Action. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal progetto AGL201568330-C2-1-R (MINECO/FEDER). David G. Valcarce è stato finanziato dalla Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) e Fondo sociale Europeo. Gli autori riconoscono Dr. Ana Riaza e Stolt Sea Farm S.A., Dr. Paulino de Paz, Dr. Ignacio Martínez Montero e José Ramón Guiérrez. Ringraziamo anche Paula Fernández Colado per videografia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
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