Evaluering av intracellulær plasseringen av reaktive oksygen arter i Solea Senegalensis Spermatozoa

Summary

Denne protokollen beskriver en detaljert metodikk for å oppdage H₂O₂ lokalisering i Solea senegalensis spermatozoa bruker en følsom fluorochrome DCFH-DA for ROS, en live mitokondrier flekk for mitokondrier og DAPI for kjerner visualisering, henholdsvis. Protokollen er utformet som skal utføres innen 2 timer med enten friske eller tinte spermatozoa.

Abstract

Oksidativt stress er en av de viktige faktorene i å redusere kvaliteten. Utvikle effektiv protokoller for å oppdage reaktive oksygen arter (ROS) i spermatozoa er av høy betydning noen arter, men disse metodene er sjelden brukt, og enda mindre i teleoster. Kryonisk bevaring er en nyttig teknikk i akvakultur for ulike formål, herunder genet bank og garantert sperm tilgjengelighet gjennom hele året. Frysing/tining prosedyrer kan forårsake ROS produksjon og skade sædceller. Vurderer den potensielle skade som kan et overskudd av ROS produksjon forårsake i spermatozoa avhengig av deres lokalisering, her en detaljert metode til å gjenkjenne H₂O₂ og evaluere sin intracellulær lokalisering av AC confocal mikroskopi tilbys. For dette formålet, en kombinasjon av 3 fluorochromes (2 ‘, 7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA), en live mitokondrier flekk og 4, 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)) brukes til å evaluere den co lokaliseringen av H₂O₂ med spermatozoa kjerner eller mitokondrier i Solea senegalesis sperm prøver.

Introduction

Reaktive oksygen arter produksjon har vært knyttet til kvaliteten nylig¹. Selv om ROS produksjon i mitokondrier kan betraktes som en normal fysiologisk prosess, er oksidativt stress av et overskudd av ROS produksjon en klar årsak til skader i spermatozoa på ulike nivåer. Hos mennesker er oksidativt stress knyttet til mannlig infertilitet, endre motilitet og muligheten til å gjennomgå capacitation²; i pattedyr, har endring av DNA integritet i frossen sæd prøver også vært knyttet til syntese H₂O₂³.

Kryonisk bevaring er en vanlig teknikk for genet i akvakultur. Denne teknologien er spesielt viktig i arter med reproduktive problemer som Solea senegalensis. Dette verdifulle arter i markedet viser reproduktive dysfunksjon i individer født i fangenskap skyldes manglende frieri. Dette faktum gjør sperm kryonisk bevaring må sperm tilgjengelighet for kunstig befruktning. Imidlertid kan kryonisk bevaring være en kilde til oksidativt stress som kan være skadelig for spermatozoa⁴ som studier har rapportert en gunstig effekt av antioksidant kosttilskudd. ROS hemming gjennom mitokondrie målrettede antioksidant var angivelig gunstig for sæden kryonisk bevaring i gul steinbit⁵.

Nivåene av ROS i sperm prøver er derfor viktig å vite, særlig etter kryonisk bevaring^6,7 fordi disse molekylene har vært anerkjent som en ulempe for sperm overlevelse og fruktbarhet⁸. Videre kan studerer fordelingen av ROS i cellen være avgjørende å antyde hvilket skader. Som et eksempel, lave nivåer av ROS i mitokondrier kan antas normal og kompatibel med sperm funksjonen, men høye nivåer av ROS i kjernen kan være indikatorer spermatozoa DNA skade. H₂O₂ er en av de mest relevante ROS som kan frigis fra mitokondrier og trenge kjernen fordi det er en liten og gratis mindre molekyl⁹. Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) kan spesielt avsløre intracellulær peroxide emitting grønne fluorescens. En detaljert protokoll for å oppdage H₂O₂ intracellulær lokalisering i Solea senegalensis sæden med AC confocal mikroskopi er presentert i denne artikkelen.

Protocol

Merk: Fluorochrome inkubasjon og AC confocal analyse vil ta minst 2-3 h for en kontroll og en behandlet prøve. Behandling er ikke inkludert i denne beregning. Nødvendig materiale kan finnes i Tabell for materiale. Denne protokollen kan brukes friske eller cryopreserved spermatozoa. Solea senegalensis er en fiskeart som gyter i kaldt vann, arbeid alltid under kalde forhold (4-7 ° C). Se figur 1 for en oversikt over protokollen. 1. forarbe…

Representative Results

AC confocal mikroskopi er en ideell måte intracellulær ROS evaluering i teleost sperm. Kombinasjonen av de tre fluorochromes (DAPI, mitokondrier flekken og DCFH-DA) presenteres i denne studien (figur 1) gir mange nyttige opplysninger som kan brukes i grunnforskning og kan ha programmer i å forbedre prosedyrer brukes i industriell oppdrett planter, for eksempel kryonisk bevaring protokoller. Ulike typer analyse kan gjennomføres for å koordinere intracellu…

Discussion

Det er velkjent at mitokondrier er viktige organelles for Spermiemotilitet og funksjon. Disse organeller er samtidig direkte involvert i ROS produksjon. Interessant, er kontrollert nivåer av ROS nødvendig for riktig sæd funksjon¹. Positive relasjoner mellom fruktbarhet og oksidativt stress har blitt vist i pattedyr¹¹ men overdreven nivåer påvirke sperm kvalitet¹². En viktig faktor som kunne være avgjørende mot en positiv eller negativ effekt e…

Materials

2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA)	Sigma-Aldrich	D6883
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542
CaCl2	Sigma-Aldrich	C1016
Confocal Microscopy	Zeiss	LSM800
Cover slips	Thermo Fisher Scientific	12-541B
DMSO, Analytical Grade	Sigma-Aldrich	W387520
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
Methanol, Analytical Grade	Sigma-Aldrich	34860
MitoTrackerDeep Red	Thermo Fisher Scientific	M22426
Microcentrifuge (refrigerated)	Thermo Fisher Scientific	75002441
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Neubauerchamber	Sigma-Aldrich	BR717810
Slides	Thermo Fisher Scientific	10143562BEF