Анализ клеточной поверхности адгезии Ремоделирование в ответ на механическое напряжение с помощью магнитных шариков
Summary
клеточной поверхности спайки являются центральными в механотрансдукции, так как они передают механические напряжения и инициировать сигнальных путей, вовлеченных в гомеостаз ткани и развития. Здесь мы приводим протокол для рассечения биохимических путей, которые активируются в ответ на напряжение, используя лиганд покрытием магнитные микрогранулы и применение силы к адгезионных рецепторов.
Abstract
Механочувствительных адгезии комплексы клеточной поверхности позволяют клеткам ощущать механические свойства их окружения. Недавние исследования выявили как силы зондирования молекул на адгезионных участков, а сила-зависимых факторов транскрипции, которые регулируют экспрессию генов LINEAGE-специфических и драйвом фенотипические выходы. Однако сигнальные сети преобразующие механическую напряженность в биохимических путей, которые остаются неясными. Для изучения сигнальных путей, участвующих на механического напряжения, приложенного к рецептором клеточной поверхности, могут быть использованы суперпарамагнитныо микрогранулы. Здесь мы приводим протокол для использования магнитных шариков для применения силы на клеточной поверхности адгезии белков. Используя этот подход, можно исследовать не только силы-зависимых цитоплазматический сигнальных путей от различных биохимических подходов, но и адгезии ремоделирования магнитной изоляции адгезионных комплексов, присоединенных к лиганд-покрытием бусин. Этот протокол включает в себя подготовку лиганд-сотрудничестваованные суперпарамагнитныо бусы и применение определить силы растяжения с последующим биохимических анализов. Кроме того, мы предоставляем репрезентативную выборку данных, показывающих, что напряжение применяется к адгезии интегрина на основе триггеров адгезии ремоделирования и изменяет белковый фосфорилирования тирозина.
Introduction
В многоклеточных, механическое напряжение направляет развитие тканей и гомеостаз посредством регуляции множества клеточных процессов , таких как пролиферации, дифференцировки и выживания 1, 2. Механическое напряжение может возникать из внеклеточного матрикса или могут быть получены с помощью адгезивных клеток, которые образец их внеклеточную среду через актомиозиновом сократительной механизма, который вытягивает на внеклеточный матрикс и зонды его жесткость при натяжении чувствительных молекул. В ответ на напряжение, механочувствительных белки адгезии претерпевают конформационные изменения, которые вызывают сложные сигнальные каскады. В свою очередь, эти сигнальные пути оркестровать mechanoresponse охватывающую пролиферацию, дифференцировку и выживание, который регулирует клеточное поведение во внеклеточную среду. Такие процессы могут быть урегулированы в краткосрочном периоде времени (секунды до нескольких минут), чтобы быстро накормить обратно на петлю механиз notransduction путем модификации механочувствительных структур. Например, интегрин на основе спайки усиления в ответ на натяжение через Rho ГТФ-опосредованной цитоскелета ремоделирования 3, 4, 5. Параллельно с этим , другие сигнальные пути активируются в течение часов и дней , чтобы контролировать генетические программы , которые в конечном итоге повлиять на судьбу клеток 6. Принимая во внимание, многие исследования выявили влияние матрицы жесткости на клеточное детерминизма и развития болезни 1, 2, точные молекулярные механизмы адгезии опосредованной механотрансдукции до сих пор остаются неуловимыми.
Различные подходы были разработаны с целью изучения влияния клеточных генерируемых сил или внешних сил на поведение клеток, в том числе систем потока, флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) -tension датчиков 7,деваха = "Xref"> 8, совместимые подложки 9, пинцет, оптический пинцет 10 и атомно – силовой микроскопии (AFM) 11. Здесь мы приводим протокол, используя суперферромагнитных шарики для характеристики механотрансдукция путей в ответ на растягивающих сил, приложенных со специфическими рецепторами адгезии. Суперпарамагнитных шарики представляют собой частицы, которые обратимо обусловливающие намагничивание при помещении в магнитном поле. После того, как покрытые лигандом для конкретного рецептора, эти шарики обеспечивают мощный инструмент для изучения влияния внеклеточной приложения силы. Этот метод был подтверждено несколькими исследованиями 3, 5, 12 – 17 и представить преимущество в значительной степени облегчить биохимический анализ на прилипшие клетки. Используя аналогичные коллаген покрытием магнитных шариков с последующим биохимического анализа, ранние работы сообщили об увеличениипротеин – тирозин – фосфорилирование и активацию RhoA в ответ на натяжение 5, 18, 19. Описанный ниже метод был также использован с фибронектином (FN) -покрытие бусинок , чтобы охарактеризовать сигнальные пути вниз по течению от напряжения , приложенного к интегринов 3. В этом исследовании, Guilluy и др. показали, что напряженность активирует RhoA путем набора двух гуанин нуклеотид обменных факторов (GEFs), Ларг и ГЭФ-H1, с интегрином адгезионных комплексов. Так что, другие исследования показали , что ГЭФ-H1 рекрутируется на адгезионных комплексов в ответ на клеточной сгенерированных напряженности с использованием различных методов 20, 21, демонстрируя устойчивость методологии , описанной здесь. В результате, активированный RhoA было установлено, способствует усиление адгезии, через цитоскелета ремоделирования. Эта система была также использована для изучения натяжения применяется то клеточной адгезии / рецепторами клеток. Применение сил на магнитных шариков , покрытых внеклеточным доменом Е-кадгерина вызвало увеличение набора винкулина аналогично интегринассоциированный адгезионных комплексов 12. Коллинз и его коллеги наблюдали , что применение напряженности PECAM-1 способствует интегрин и активации RhoA 13. Другой экспериментальный подход с использованием магнитных шариков является изучение натяжения применительно к изолированных ядер. Используя шарики , покрытые антителами , направленными против белка ядерной оболочки nesprin-1, оболочечные комплексы ядерных очищались , чтобы показать , что они динамически регулируется в ответ на механическое натяжение 22. Эти результаты подтверждают всемогущество этого метода в изучении механотрансдукции путей. Кроме того, в то время как поток или тяговое усилие системы стимулируют общие клеточные процессы, магнитные шарики, специально нацелены на рецептор клеточной адгезии с использованием либо лиганды рецептора <suр класс = "Xref"> 3 или моноклональные антитела против рецептора клеточной поверхности 13, 15.
Еще одним преимуществом этого метода является выделение адгезионных комплексов посредством простой процедуры очистки лиганда сродства. Хорошо известно , что добавление лиганда покрытием бус клеток связывается с рецепторами адгезии и вызывает набор нескольких адгезивных белков 23. Дальнейшее применение сил лиганд-покрытием магнитных шариков превращает эти адгезионные комплексы в макромолекулярных платформ, опосредует различные натяжные-зависимые сигнальные пути , 4, 24. Лизис клеток с последующей концентрацией шарик с помощью магнита позволяет выделить адгезионных платформ. Другие методы, используемые для очистки адгезии комплексы уже использовались в прикрепленных клетках. Они сочетают в себе химическое сшивание, чтобы сохранить белок-белковых взаимодействийи стадию лизиса клеток с помощью моющего средства и сдвига потока или обработки ультразвуком 20, 21, 25, 26, 27, 28. Последним шагом является сбор полученных брюшных плазменных мембран, содержащих адгезионных комплексов. В отличие от этих методов, магнитные шарики позволяют большую степень очистки клеточной адгезии комплексов путем селективного ориентации конкретного семейства рецепторов адгезии. Магнитные шарики уже используют для очистки адгезионные комплексов в неприлипающими клеток , прикрепленных к микрошариков лиганд-покрытием 29, 30. Метод, описанный ниже, имитирует биологических ситуациях, когда сила приложена в течение короткого периода (продолжительного секунд до минут). Таким образом, он представляет собой мощный инструмент для исследования как молекулярный состав очищенных адгезионных комплексов ивниз по течению механочувствительных-сигнальных путей.
Здесь мы представляем подробный экспериментальный протокол для использования магнитных шариков, чтобы применить растягивающие силы на поверхности адгезии белков. Постоянный неодимовый магнит помещается на верхней части поверхности культуры блюдо. Поверхность полюса магнита помещают на высоте 6 мм , так что усилие на одной магнитной бусинки 2,8 мкм постоянна (около 30-40 Pn) 31. Длительность стимуляции натяжения определяется оператором в зависимости от интересующей молекулы и ее масштаб времени активации. Клетки в конце концов лизируют, адгезивные комплексы очищают с помощью разделения бусин с помощью магнита и биохимические анализы обрабатываются. Этот протокол включает в себя получение лиганда покрытием суперпарамагнит- шариков, а также применение напряженности с помощью магнита с последующим биохимических анализов. Кроме того, мы предоставляем репрезентативную выборку данных, показывающих, что напряжение применяется к интегрину на основе АДГesions индуцирует адгезию ремоделирования и изменяет белковый фосфорилирования тирозина.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный здесь метод представляет собой простой подход, чтобы применить напряжение к клеточной поверхности рецепторов адгезии и позволяют их последующую очистку. Тем не менее, некоторые шаги имеют решающее значение для выполнения эффективной очистки адгезии и потенциал оптимизаци?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CG поддерживается за счет грантов от Национального агентства-де-ла-Recherche (ANR-13-JSV1-0008), из седьмой рамочной программы Европейского союза (Мари Кюри Карьера интеграции n˚8304162) и от Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках Horizon Европейского Союза 2020 исследований и инноваций программы (ERC Запуск Грант n˚639300).
Materials
| Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | DX88-N52 | grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick |
| Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | D84PC-BLK | grade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated |
| Dynabeads M280 Tosylactivated | Thermofisher | 14203 | superparamagnetic beads |
| DynaMag-2 Magnet | Thermofisher | 12321D | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | Fibronectin from bovine plasma |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1428-50MG | Bovine Apo-Transferrin |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate | Life Technologies | 31966-021 | DMEM+GlutaMAX-I 500 ml |
| 60*15 mm culture dish | Falcon | 353004 |
References
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. L. . Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (5), 308-319 (2011).
- Guilluy, C., et al. The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins. Nat Cell Biol. 13 (6), 722-727 (2011).
- Matthews, B. D., Overby, D. R., Mannix, R., Ingber, D. E. Cellular adaptation to mechanical stress: role of integrins, Rho, cytoskeletal tension and mechanosensitive ion channels. J Cell Sci. 119 (3), 508-518 (2006).
- Zhao, X. -. H., et al. Force activates smooth muscle alpha-actin promoter activity through the Rho signaling pathway. J Cell Sci. 120 (Pt 10), 1801-1809 (2007).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Austen, K., Kluger, C., Freikamp, A., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. Generation and analysis of biosensors to measure mechanical forces within cells. Meth Mol Biol. 1066, 169-184 (2013).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Pelham, R. J., Wang, Y. l. . Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci USA. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Chaudhuri, O., Parekh, S. H., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Combined atomic force microscopy and side-view optical imaging for mechanical studies of cells. Nat Meth. 6 (5), 383-387 (2009).
- Bays, J. L., et al. Vinculin phosphorylation differentially regulates mechanotransduction at cell-cell and cell-matrix adhesions. J Cell Biol. 205 (2), 251-263 (2014).
- Collins, C., et al. Localized tensional forces on PECAM-1 elicit a global mechanotransduction response via the integrin-RhoA pathway. Curr Biol. 22 (22), 2087-2094 (2012).
- Gordon, W. R., et al. Mechanical Allostery: Evidence for a Force Requirement in the Proteolytic Activation of Notch. Dev Cell. 33 (6), 729-736 (2015).
- Lessey-Morillon, E. C., et al. The RhoA guanine nucleotide exchange factor, LARG, mediates ICAM-1-dependent mechanotransduction in endothelial cells to stimulate transendothelial migration. J Immunol. 192 (7), 3390-3398 (2014).
- Osborne, L. D., et al. TGF-β regulates LARG and GEF-H1 during EMT to affect stiffening response to force and cell invasion. Mol Biol Cell. 25 (22), 3528-3540 (2014).
- Scott, D. W., Tolbert, C. E., Burridge, K. Tension on JAM-A activates RhoA via GEF-H1 and p115 RhoGEF. Mol Biol Cell. 27 (9), 1420-1430 (2016).
- Glogauer, M., Ferrier, J., McCulloch, C. A. Magnetic fields applied to collagen-coated ferric oxide beads induce stretch-activated Ca2+ flux in fibroblasts. Am J Physiol – Cell Physiol. 269 (5), C1093-C1104 (1995).
- Glogauer, M., et al. Calcium ions and tyrosine phosphorylation interact coordinately with actin to regulate cytoprotective responses to stretching. J Cell Sci. 110 (Pt 1), 11-21 (1997).
- Kuo, J. -. C., Han, X., Hsiao, C. -. T., Yates, J. R., Waterman, C. M. Analysis of the myosin-II-responsive focal adhesion proteome reveals a role for β-Pix in negative regulation of focal adhesion maturation. Nat Cell Biol. 13 (4), 383-393 (2011).
- Schiller, H. B., et al. β1- and αv-class integrins cooperate to regulate myosin II during rigidity sensing of fibronectin-based microenvironments. Nat Cell Biol. 15 (6), 625-636 (2013).
- Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nat Cell Biol. 16 (4), 376-381 (2014).
- Plopper, G. E., McNamee, H. P., Dike, L. E., Bojanowski, K., Ingber, D. E. Convergence of integrin and growth factor receptor signaling pathways within the focal adhesion complex. Mol Biol Cell. 6 (10), 1349-1365 (1995).
- Roca-Cusachs, P., Gauthier, N. C., Del Rio, ., A, M. P., Sheetz, Clustering of alpha(5)beta(1) integrins determines adhesion strength whereas alpha(v)beta(3) and talin enable mechanotransduction. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (38), 16245-16250 (2009).
- Ajeian, J. N., et al. Proteomic analysis of integrin-associated complexes from mesenchymal stem cells. Proteomics Clin Appl. 10 (1), 51-57 (2016).
- Horton, E. R., Astudillo, P., Humphries, M. J., Humphries, J. D. Mechanosensitivity of integrin adhesion complexes: Role of the consensus adhesome. Exp Cell Res. , (2015).
- Jones, M. C., et al. Isolation of integrin-based adhesion complexes. Curr Protoc Cell Biol. 66, 9.8.1-9.8.15 (2015).
- Ng, D. H. J., Humphries, J. D., Byron, A., Millon-Frémillon, A., Humphries, M. J. Microtubule-dependent modulation of adhesion complex composition. PloS One. 9 (12), e115213 (2014).
- Byron, A., Humphries, J. D., Bass, M. D., Knight, D., Humphries, M. J. Proteomic analysis of integrin adhesion complexes. Sci Sign. 4 (167), pt2 (2011).
- Byron, A., Humphries, J. D., Craig, S. E., Knight, D., Humphries, M. J. Proteomic analysis of α4β1 integrin adhesion complexes reveals α-subunit-dependent protein recruitment. Proteomics. 12 (13), 2107-2114 (2012).
- Marjoram, R. J., Guilluy, C., Burridge, K. Using magnets and magnetic beads to dissect signaling pathways activated by mechanical tension applied to cells. Methods. , (2015).
- Pasapera, A. M., Schneider, I. C., Rericha, E., Schlaepfer, D. D., Waterman, C. M. Myosin II activity regulates vinculin recruitment to focal adhesions through FAK-mediated paxillin phosphorylation. J Cell Biol. 188 (6), 877-890 (2010).
- Sawada, Y., Sheetz, M. P. Force transduction by Triton cytoskeletons. J Cell Biol. 156 (4), 609-615 (2002).
- Grinnell, F., Geiger, B. Interaction of fibronectin-coated beads with attached and spread fibroblasts. Binding, phagocytosis, and cytoskeletal reorganization. Exp Cell Res. 162 (2), 449-461 (1986).
- Schroeder, F., Kinden, D. A. Measurement of phagocytosis using fluorescent latex beads. J Biochem Biophys Meth. 8 (1), 15-27 (1983).
- Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
- Seo, D., et al. A Mechanogenetic Toolkit for Interrogating Cell Signaling in Space and Time. Cell. 165 (6), 1507-1518 (2016).
