mekanik gerilim iletmek ve doku homeostazında ve geliştirme dahil sinyal yollarını başlatmak gibi hücre yüzey yapışıklıklar, mechanotransduction merkezi bulunmaktadır. Burada, ligand kaplı manyetik mikroboncukları ve yapışma reseptörlerine kuvvet uygulaması ile, gerilim cevap olarak aktive edilir biyokimyasal yollar kesme için bir protokol mevcut.
Mechanosensitive hücre yüzeyi yapışma kompleksleri hücreler ortamda mekanik özellikleri duyu sağlar. Son zamanlarda yapılan çalışmalar adhezyon bölgelerinin kuvvet algılayıcı molekülleri, ve soy spesifik gen ekspresyonunu düzenleyen ve fenotipik çıktıları sürücü kuvveti bağımlı transkripsiyon faktörlerini belirledik. Ancak, biyokimyasal yollar içine mekanik gerilim dönüştürme sinyal ağları yakalanması zor kalmıştır. hücre yüzey reseptörüne uygulanan mekanik gerilim ile yapan sinyal yollarını araştırmak için, süperparamanyetik mikroboncuklar kullanılabilir. Burada hücre yüzeyi yapışma proteinlerine kuvvetleri uygulamak için, manyetik boncuklar kullanılarak bir protokol mevcut. Bu yaklaşımı kullanarak, ligand kaplı boncuklara bağlı yapışma kompleksleri manyetik izolasyonu ile, sadece bir güç bağımlı çeşitli biyokimyasal yaklaşımlar ile sitoplazmik sinyal yollarını ancak yapışma biçimlenme araştırılması mümkündür. Bu protokol ligand-co hazırlanmasını içermektedirated Süperparamanyetik boncuklar ve uygulama biyokimyasal analizler takip gerilme kuvvetleri tanımlar. Ayrıca, integrin tabanlı yapışma uygulanan gerilimin gösteren verilerin temsili numune yapışma biçimlenme tetikler ve protein tirozin fosforilasyonu değiştirir sağlar.
Metazoada olarak, mekanik gerilme, proliferasyon, farklılaşma ve canlılık, 1, 2 gibi hücresel süreçleri sayısız düzenleme ile doku gelişimi ve homeostazı yönlendirir. Mekanik gerilim hücre dışı matrisin ortaya çıkabilir veya yapışık hücreler, örnek hücre-dışı matris üzerine çeker ve gerginlik duyarlı moleküllerin yoluyla sertliğini probları aktomiyosin kontraktil makineler yoluyla hücre dışı ortamı ile üretilebilir. gerilime karşılık olarak, mechanosensitive yapışma proteinleri, karmaşık bir sinyal gruplarının tetiklenmesinde uygun değişikliklere uğrar. Buna karşılık, bu sinyal yolları hücre dışı ortama hücresel davranış ayarlar proliferasyonu, farklılaşması ve hayatta kalma kapsayan bir mechanoresponse orkestra. Bu tür süreçler hızla mekanizmalarının döngü üzerine geri beslemeye (saniye dakika) kısa vadeli bir sürede çözülebilecek mechanosensitive yapıları değiştirerek notransduction. Örneğin, integrin göre yapışıklık Rho GTPaz aracılı hücre iskeleti yeniden 3, 4, 5 arasındaki gerilim yanıt olarak güçlendirir. Buna paralel olarak, diğer sinyal yollarının sonunda hücre kaderi 6 etkileyen genetik programları kontrol etmek için saat ve gün içinde aktif hale getirilir. Birçok çalışma, hücre determinizm ve hastalık gelişimi 1, 2 matris sertlik etkisini vurgulamıştır Oysa, yapışma aracılı mechanotransduction kesin moleküler mekanizmalar hala zor kalır.
Çeşitli yaklaşımlar, akış sistemleri, flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) -tension sensörleri 7 de dahil olmak üzere hücre davranışı hücre tarafından üretilen kuvvetler veya dış kuvvetlerin etkilerini incelemek için geliştirilmiştirlass = "xref"> 8 uyumlu yüzeyler 9, manyetik cımbız, optik cımbız 10 ve atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) 11. Burada belirli bir yapışma reseptörleri uygulanan gerilme kuvvetlerine karşılık olarak mechanotransduction yolları karakterize süperparamanyetik boncuklar kullanılarak, bir protokol mevcut. Süperparamanyetik boncuklar bir manyetik alan içine konulduğunda, tersine çevrilebilir manyetize parçacıklardır. Bir kez özel bir reseptör için bir ligand ile kaplı, bu boncuklar hücre dışı bir güç uygulamanın etkilerini incelemek için güçlü bir araç sunar. Bu yöntem bazı çalışmalarda 3, 5, 12 ile onaylandı – 17 ve büyük ölçüde yapışık hücreleri üzerinde biyokimyasal analizi kolaylaştırmak için avantaj sunuyoruz. Biyokimyasal analizi ile takip benzer kollajen kaplı manyetik boncuklar kullanılarak, erken iş bir artış olduğunu bildirdigerilim 5, 18, 19 karşılık olarak protein tirozin fosforilasyon ve RhoA aktivasyonu. Aşağıda tarif edilen yöntem, aynı zamanda integrin 3 uygulanan gerilimden aşağı sinyalleme yolunu tanımlamak için fibronektin (FN) kaplı boncuklar ile kullanılmıştır. Bu çalışmada, Guilluy ve ark. gerginlik integrin yapışma kompleksleri iki guanin nükleotid değişim faktörleri (gefs), LARG ve GEF-H1, işe yoluyla RhoA aktive olduğunu gösterdi. Bu yana, diğer çalışmalar GEF-H1, burada açıklanan metodolojiye sağlamlığını gösteren farklı yöntemler 20, 21 kullanılarak hücre tarafından üretilen gerilim yanıt olarak yapışma kompleksleri için işe olduğunu göstermiştir. Bunun bir sonucu olarak, aktive edilmiş RhoA sitoskeletal yeniden ile, yapışma takviye sağladığı gösterilmiştir. Bu sistem, aynı zamanda gerilim tatbik t araştırmak için kullanıldıHücre / hücre adezyon reseptörleri o. İntegrin ilişkili adhezyon kompleksleri 12 benzer vinkulin işe bir artışa neden olmadan E-kaderin hücre dışı kaplanmış manyetik boncuklar üzerine kuvvetlerinin uygulanması. Collins ve arkadaşları PECAM-1 integrin teşvik ve RhoA aktivasyonu 13 gerginlik bu uygulama görülmektedir. manyetik boncuklar kullanarak başka deneysel bir yaklaşım izole çekirdekleri uygulanan gerilim çalışmadır. Nesprin-1 çekirdek zarı proteine karşı antikorlarla kaplanmış boncuklar kullanılarak, çekirdek zarı kompleksleri dinamik mekanik gerilim 22 yanıt olarak ayarlanır olduğunu göstermek için saflaştırılmıştır. Bu sonuçlar, mechanotransduction yollarının çalışmada bu yöntemin güçlülüğü destekler. Akış veya çekme kuvveti sistemleri genel olarak hücresel işlemleri teşvik Dahası, manyetik boncuk özel reseptör ligandları kullanarak, bir hücre yapışma reseptörünü hedefleyen <sup class = "xref"> 3 veya hücre yüzey reseptörüne 13, 15 karşı monoklonal antikorlar.
Bu yöntemin diğer bir avantajı, basit bir bağ afinite saflaştırma prosedürü ile yapışma komplekslerinin izolasyondur. İyi hücrelere ligand kaplı boncuklar ilave yapışma reseptörleri bağlayan ve çeşitli yapışma proteinlerinin 23 alımı uyardığı bilinmektedir. Ligand kaplı manyetik boncuklar kuvvetlerin daha uygulaması 24, farklı gerilim bağımlı sinyalleme yolunu 4 aracılık makromoleküler platformlara bu yapışma kompleksleri döner. Bir mıknatıs kullanılarak kordon konsantrasyon izledi hücre liziz yapışma platformları izolasyonunu mümkün kılar. adezyon kompleksleri saflaştırmak için kullanılan diğer yöntemler, daha önce yapışkan hücreler kullanılmaktadır. Bunlar protein-protein etkileşimlerini muhafaza etmek için kimyasal çapraz-bağlanmasını birleştirirve deterjan ve kesme akış veya sonikasyon 20, 21, 25, 26, 27, 28, bir hücre parçalama adımı. Son adım yapışma kompleksleri içeren nihai ventral plazma zarlarının topluluğudur. Bu yöntemlerden farklı olarak, manyetik boncuk seçici adezyon reseptörlerinin özel bir ailesi hedef hücre yapışması kompleksleri daha büyük bir saflaştırma seviyesi sağlar. Manyetik boncuklar daha önce ligand kaplı mikro-29, 30 bağlı yapışmayan hücreler adezyon kompleksleri saflaştırılması için kullanılmıştır. kuvvet, kısa sürekli bir süre (dakika saniye) uygulanır taklit biyolojik durumlar aşağıda açıklanan yöntem. Bu nedenle, arıtılmış yapışma komplekslerinin moleküler kompozisyonu hem de soruşturma için güçlü bir araç sağlar veaşağı mechanosensitive-sinyal yolları.
Burada yapışma yüzey proteinlerine gerilme kuvvetlerinin uygulamak için manyetik boncuklar kullanılarak için ayrıntılı bir deneysel protokol mevcut. Kalıcı Neodimyum mıknatıs kültür çanak yüzeyinin üstüne yerleştirilir. Tek bir 2.8 mikron manyetik boncuk kuvvet sabiti (yaklaşık 30-40 pN) 31 böylece mıknatıs kutup yüzü 6 mm yükseklikte yer almaktadır. Germe uyarım süresi çıkar ve aktivasyon zamanı ölçekli molekülüne bağlı olarak operatör tarafından belirlenir. Hücreler nihayet yapışma kompleksleri bir mıknatıs kullanarak boncuk ayırma ile saflaştırılmış ve biyokimyasal analizler işlenir, parçalanır. Bu protokol, ligand kaplamalı süperparamanyetik tanelerin hazırlanması ve biyokimyasal analizler, ardından Mıknatıs gerilim uygulanmasını içerir. Ayrıca, integrin tabanlı ADH uygulanan bu gerilim gösteren bir veri temsil eden örnek sunmakesions yapışma biçimlenme indükler ve protein tirosin fosforilasyonunu değiştirir.
Burada tarif edilen yöntem, hücre yüzeyi yapışma reseptörlerine gerilim uygulamak ve daha sonra saflaştırmaya olanak sağlamak üzere basit bir yaklaşım oluşturmaktadır. Ancak, bazı adımlar hedeflenen yapışma reseptörleri bağlı verimli yapışma arıtma ve potansiyel iyileştirme yapılabilir gerçekleştirmek için kritik öneme sahiptir. Biz kullanıcı aşağıda karşılaşabileceğiniz olası sorunları sunuyoruz.
Bu 2.8 mikron çapında manyetik boncuklar kullanılab…
The authors have nothing to disclose.
CG, Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı Agence National de la Recherche (ANR-13-JSV1-0008), (Marie Curie Kariyer Entegrasyon n˚8304162) ve Avrupa Birliği'nin Horizon kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) hibe tarafından desteklenmektedir 2020 araştırma ve yenilik programı (ERC Başlangıç Hibe n˚639300).
Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | DX88-N52 | grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick |
Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | D84PC-BLK | grade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated |
Dynabeads M280 Tosylactivated | Thermofisher | 14203 | superparamagnetic beads |
DynaMag-2 Magnet | Thermofisher | 12321D | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | Fibronectin from bovine plasma |
Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | |
Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1428-50MG | Bovine Apo-Transferrin |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate | Life Technologies | 31966-021 | DMEM+GlutaMAX-I 500 ml |
60*15 mm culture dish | Falcon | 353004 |