Het analyseren van de celoppervlakadhesie remodeling in reactie op mechanische spanning met behulp van Magnetic Beads

Summary

Celoppervlak verklevingen staan ​​centraal in mechanotransductie, omdat ze mechanische spanning verzenden en inleiding van de signaalwegen die betrokken zijn in het weefsel homeostase en ontwikkeling. Hier presenteren we een protocol voor het ontleden van de biochemische routes die worden geactiveerd in reactie op de spanning, onder toepassing van ligand beklede magnetische microkralen en krachtuitoefening adhesie receptoren.

Abstract

Mechanosensitieve celoppervlak adhesie complexen laat cellen om de mechanische eigenschappen van hun omgeving detecteren. Recente studies hebben zowel force sensing moleculen aan adhesieplaatsen en kracht-afhankelijke transcriptiefactoren die lijn genexpressie reguleren en rijden fenotypische uitkomsten van. Echter, de signalering netwerken omzetten van mechanische spanning in biochemische routes bleef ongrijpbaar. Om de signaalwegen betrokken bij mechanische spanning aangebracht op het celoppervlak receptor te verkennen, kan superparamagnetische microkralen worden gebruikt. Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van magnetische korrels krachten toepassing celoppervlak adhesie-eiwitten. Met deze aanpak kan men niet alleen kracht-afhankelijke cytoplasmatische signaleringsroutes door verschillende biochemische benaderingen, maar ook adhesie remodellering onderzoeken door magnetische isolatie van adhesie complexen aan de ligand-gecoate kralen. Dit protocol omvat de bereiding van ligand-coated superparamagnetische delen en de toepassing van vast trekkrachten gevolgd door biochemische analyses. Daarnaast bieden wij een representatieve steekproef van gegevens die aantonen dat de spanning toegepast op-integrine gebaseerde adhesie triggers hechting renovatie en verandert eiwittyrosinefosforylatie.

Introduction

In metazoen, mechanische spanning regisseert weefsel ontwikkeling en homeostase door middel van de regulering van een groot aantal cellulaire processen zoals proliferatie, differentiatie en overleving ^{1, 2.} Mechanische spanning kan ontstaan ​​uit de extracellulaire matrix of kunnen worden gegenereerd door hechtende cellen, welk monster de extracellulaire omgeving via actomyosine contractiele machinerie die trekt op extracellulaire matrix en sondes zijn stijfheid met spanningsgevoelige moleculen. In reactie op spanning mechanosensitieve adhesieproteïnen ondergaan conformationele veranderingen die complexe signalering cascades activeren. In reactie op deze signaalwegen orkestreren een mechanoresponse omvat proliferatie, differentiatie en overleving dat de cellulaire gedrag de extracellulaire omgeving aanpast. Dergelijke processen kunnen worden geregeld in een korte tijd (seconden tot minuten) om snel terug te voeren op de lus van mecha notransduction door aanpassing van de mechanosensitieve structuren. Bijvoorbeeld integrine-gebaseerde adhesies versterken als reactie op spanning door middel Rho GTPase-gemedieerde cytoskelet remodeling ^{3, 4, 5.} Tegelijkertijd worden ook andere signaleringsroutes geactiveerd via uren en dagen van genetische programma's die uiteindelijk van invloed zijn cel lot ⁶ beheersen. Dat, hebben vele studies de effecten van Matrix stijfheid op mobiele determinisme en ziekteontwikkeling ^{1, 2} gemarkeerd, de precieze moleculaire mechanismen van adhesie gemedieerde mechanotransductie nog steeds ongrijpbaar.

Verschillende benaderingen zijn ontwikkeld om de effecten van cel optredende krachten of uitwendige krachten op celgedrag, waaronder stroomsystemen, fluorescentie-energieoverdracht (FRET) -tension sensors ^{7 bestuderen}lass = "xref"> 8, compliant substraten ^9, magnetische pincet, optisch pincet ¹⁰ en atomic force microscopie (AFM) ^11. Hier presenteren we een protocol gebruiken superparamagnetische kralen mechanotransductie pathways te karakteriseren als reactie op trekkrachten toegepast op specifieke adhesiereceptoren. Superparamagnetische deeltjes die reversibel magnetiseren wanneer geplaatst in een magnetisch veld. Eenmaal bekleed met een ligand voor een bepaalde receptor, deze kralen een krachtig hulpmiddel om de effecten van extracellulair krachtuitoefening bestuderen. Deze methode is gevalideerd door verscheidene studies ^{3, 5, 12-17} en brengt het voordeel van biochemische analyse van hechtende cellen grotendeels vergemakkelijken. Met soortgelijk met collageen beklede magnetische korrels gevolgd door biochemische analyse, vroege werk rapporteerde een stijgingeiwittyrosinefosforylatie en RhoA activatie als reactie op spanning ^{5, 18, 19.} De hieronder beschreven methode is ook gebruikt met fibronectine (FN) beklede kralen om de signaalwegen stroomafwaarts karakteriseren van spanning toegepast integrinen ^3. In deze studie GUILLUY et al. toonde aan dat de spanning activeert RhoA door de werving van de twee guanine nucleotide uitwisseling factoren (GEFs), LARG en GEF-H1, naar integrine adhesie complexen. Sindsdien hebben andere studies aangetoond dat GEF-H1 is aangeworven om adhesie complexen in reactie op cel gegenereerde spanning op verschillende manieren ^{20, 21,} waaruit de robuustheid van de hier beschreven methode. Dientengevolge werd geactiveerd RhoA aangetoond hechting versterking bevorderen door cytoskelet remodeling. Dit systeem werd ook gebruikt om staand spanning wordt toegepast to cel / cel adhesie receptoren. Toepassing van krachten op magnetische bolletjes gecoat met het extracellulaire domein van E-cadherine-geïnduceerde verhoging van vinculin recruitment soortgelijke integrine geassocieerd hechting complexen ^12. Collins en collega's opgemerkt dat de toepassing van spanning op PECAM-1 bevordert integrine en RhoA activeren ^13. Een andere experimentele aanpak met behulp van magnetische bolletjes is de studie van de spanning toegepast op geïsoleerde kernen. Gebruik parels bekleed met antilichamen tegen nucleaire envelopeiwit nesprin-1 werden kernenvelop complexen gezuiverd aantonen dat zij dynamisch gereguleerd in reactie op mechanische spanning ^22. Deze resultaten ondersteunen de almacht van deze methode in de studie van mechanotransductie trajecten. Bovendien, terwijl stroom of trekkracht systemen stimuleren algemene cellulaire processen, magnetische korrels specifiek op een celadhesie receptor met behulp van receptorliganden <sup class = "xref"> 3 of monoklonale antilichamen tegen celoppervlak receptor ^{13, 15.}

Een ander voordeel van deze methode is de isolatie van hechting complexen door een eenvoudige ligandaffiniteit zuiveringsprocedure. Het is algemeen bekend dat toevoeging van ligand-gecoate bolletjes aan cellen bindt adhesie receptoren induceert en de rekrutering van diverse adhesie-eiwitten ^23. Verdere toepassing van de strijdkrachten-ligand gecoate magnetische bolletjes blijkt deze adhesie complexen in macromoleculaire platforms dat verschillende spanning-afhankelijke signaalwegen ^{4 bemiddelt, 24.} Cellysis gevolgd door concentratie kraal met een magneet maakt de isolatie van de hechting platforms. Andere methoden toegepast om de hechting complexen zuiveren zijn al gebruikt in hechtende cellen. Zij combineren chemische verknoping eiwit-eiwit interacties behoudenen een cel-lysis stap detergens en schuifkracht of sonificatie ^{20, 21, 25, 26, 27, 28.} De laatste stap is het verzamelen van de resulterende ventrale plasma membranen die de hechting complexen. In tegenstelling tot deze methoden, magnetische bolletjes in een grotere zuivering niveau van cel adhesie complexen door het selectief richt op een specifieke familie van adhesie receptoren. Magnetische korrels zijn reeds toegepast om de hechting complexen zuiveren in niet-hechtende cellen gehecht aan ligand-gecoate microkorrels ^{29, 30.} De methode die hieronder bootst biologische situaties beschreven waarbij kracht wordt uitgeoefend voor een korte aanhoudende periode (seconden tot minuten). Daarom is een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van de moleculaire samenstelling van gezuiverde adhesie complexen ende downstream mechanosensitieve-signaalwegen.

Hier presenteren we een gedetailleerd experimenteel protocol voor het gebruik van magnetische korrels aan trekkrachten van toepassing op de hechting oppervlakte-eiwitten. Een permanente neodymium magneet bovenop de kweekschaal oppervlak. Het pooloppervlak van de magneet op een hoogte van 6 mm, zodat de kracht op een 2,8 urn magnetische korrels constant (ongeveer 30-40 pN) ^31. De duur van spanning stimulatie wordt bepaald door de operator afhankelijk van het molecuul van belang en de tijdschaal van activatie. Cellen worden gelyseerd slotte, adhesie complexen worden gezuiverd met kralen kleurscheiding met een magneet en biochemische analyses worden verwerkt. Dit protocol omvat de bereiding van ligand-beklede superparamagnetische delen en de toepassing van spanning door Magneet gevolgd door biochemische analyses. Daarnaast bieden wij een representatieve steekproef van gegevens die aantonen dat de spanning toegepast op-integrine gebaseerde adhesions induceert hechting renovatie en verandert eiwittyrosinefosforylatie.

Protocol

1. Ligand Conjugatie naar Magnetic Beads Opmerking: Ligand conjugatie wordt uitgevoerd met behulp superparamagnetische-tosyl geactiveerde kralen met een diameter 2,8 urn (voorraadoplossing concentratie 10 8 kralen / ml, 30 mg kralen / ml). Het volgende protocol is gebaseerd op monsters van ongeveer 2 x 10 5 cellen, die overeenkomen met MRC-5-cellen gekweekt tot 80% confluentie in een 60 mm weefselkweekplaat. Pas het volume van kralen en reagentia dienovereenkomstig bij ge…

Representative Results

Het schema van de techniek wordt geïllustreerd in figuur 1a. Na conjugatie ligand, worden magnetische korrels geïncubeerd met cellen gedurende 20 min, en daarna een permanente magneet wordt gebruikt om trekkrachten toepassing van ongeveer 30-40 pN van verschillende tijdsduur. Figuur 1b toont 2,8 um FN-beklede magnetische korrels gebonden aan MRC5 celadhesie receptoren. De wasstappen van superparamagnetische na cellysis zijn van cruciaal belang en bepalen d…

Discussion

De hier beschreven methode is een eenvoudige benadering van spanning celoppervlak adhesie receptoren brengen en laten hun daaropvolgende zuivering. Sommige stappen zijn essentieel voeren efficiënte hechting zuivering en mogelijke optimalisatie kan afhankelijk van de beoogde hechting receptoren. We presenteren potentiële problemen kan de gebruiker hieronder tegenkomen.

We gebruikten 2,8 urn diameter magnetische korrels maar grotere kralen kunnen worden gebruikt, zoals 4,5 pm diameter. Toch …

Materials

Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish)	K&J Magnetics, Inc	DX88-N52	grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick
Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish)	K&J Magnetics, Inc	D84PC-BLK	grade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated
Dynabeads M280 Tosylactivated	Thermofisher	14203	superparamagnetic beads
DynaMag-2 Magnet	Thermofisher	12321D
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141-5MG	Fibronectin from bovine plasma
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280-5MG
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1428-50MG	Bovine Apo-Transferrin
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906-500G
DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate	Life Technologies	31966-021	DMEM+GlutaMAX-I 500 ml
60*15 mm culture dish	Falcon	353004