Analyse Cell Surface Vedhæftning Remodeling i Reaktion på Mekanisk Tension Brug magnetiske perler

Summary

Cell overflade sammenvoksninger er centrale i mechanotransduction, da de sender mekanisk spænding og indlede signalveje involveret i vævshomeostase og udvikling. Her præsenterer vi en protokol for at dissekere de biokemiske veje, der aktiveres som reaktion på spænding, ved hjælp af ligand-overtrukne magnetiske mikrokugler og force ansøgning til vedhæftning receptorer.

Abstract

Mekanosensitive celleoverflade adhæsionskomplekser tillader celler at fornemme de mekaniske egenskaber af deres omgivelser. Nylige undersøgelser har identificeret både kraft-sensing molekyler ved vedhæftning sites, og kraft-afhængige transkriptionsfaktorer, der regulerer slægt-specifikke genekspression og drive fænotypiske udgange. Imidlertid har de signalering netværk konvertere mekanisk spænding i biokemiske veje været undvigende. At udforske de signalveje beskæftiget ved mekanisk spænding påføres celleoverfladereceptor, kan superparamagnetiske mikroperler anvendes. Her præsenterer vi en protokol til at bruge magnetiske perler til at anvende styrker til celleoverfladen adhæsionsproteiner. Ved anvendelse af denne fremgangsmåde, er det muligt at undersøge ikke eneste kraft-afhængig cytoplasmatisk signalveje fra forskellige biokemiske metoder, men også adhæsion remodellering ved magnetisk isolering af adhæsionskomplekser knyttet til ligand-coatede perler. Denne protokol omfatter udarbejdelse af ligand-coerede superparamagnetiske perler og anvendelse af definere trækkræfter efterfulgt af biokemiske analyser. Derudover tilbyder vi et repræsentativt udsnit af data, der viser, at spændingen anvendes på integrin-baserede vedhæftning udløser vedhæftning remodellering og ændrer proteintyrosinphosphorylering.

Introduction

I Metazoa, mekanisk spænding dirigerer væv udvikling og homeostase gennem regulering af et utal af cellulære processer såsom proliferation, differentiering og overlevelse ^{1, 2.} Mekaniske spænding kan opstå fra den ekstracellulære matrix eller kan genereres ved adhærente celler, som prøven deres ekstracellulære miljø gennem actomyosin kontraktile maskiner, der trækker på ekstracellulær matrix og prober sin stivhed gennem spændinger følsomme molekyler. Som reaktion på spænding, mekanosensitive adhæsionsproteiner undergå konformationsændringer der udløser komplekse signalleringskaskader. Til gengæld er disse signalveje iscenesætte en mechanoresponse omfatter proliferation, differentiering og overlevelse, der justerer cellulær adfærd til det ekstracellulære miljø. Sådanne processer kan afvikles i en kortvarig periode (sekunder til minutter) til hurtigt at fodre tilbage på løkke af mecha notransduction ved at ændre de mekanosensitive strukturer. For eksempel integrin-baserede adhæsioner styrke i afhængighed af spændingen gennem Rho GTPase-medieret cytoskeletal remodeling ^{3, 4, 5.} Samtidig er andre signalveje aktiveret i løbet af timer og dage at kontrollere genetiske programmer, der i sidste ende påvirke celle skæbne ^6. Betragtninger, har mange undersøgelser fremhævet effekten af matrix stivhed på celle determinisme og sygdom udvikling ^{1, 2,} de præcise molekylære mekanismer i vedhæftning-medieret mechanotransduction stadig undvigende.

Der er udviklet forskellige metoder til at undersøge virkningerne af celle-genereret kræfter eller eksterne kræfter på celle adfærd, herunder flow-systemer, fluorescens resonans (FRET) -tension sensorer ^7,lass = "xref"> 8, kompatible substrater ^9, magnetiske pincet, optisk pincet ¹⁰ og atomic force mikroskopi (AFM) ^11. Her præsenterer vi en protokol ved hjælp superparamagnetiske perler til at karakterisere mechanotransduction veje som reaktion på trækkræfter anvendes til specifikke vedhæftning receptorer. Superparamagnetiske perler er partikler, der reversibelt magnetize når den placeres i et magnetisk felt. Når belagt med en ligand for en specifik receptor, disse perler er et effektivt værktøj til at undersøge virkningerne af ekstracellulær kraftpåvirkning. Denne metode er blevet valideret af flere undersøgelser ^{3, 5, 12 – 17} og præsentere fordel at stort set lette biokemisk analyse på klæbende celler. Under anvendelse af lignende collagen-coatede magnetiske perler efterfulgt af biokemisk analyse, tidlige arbejde rapporteret en stigning iproteintyrosinphosphorylering og RhoA aktivering som respons på spænding ^{5, 18, 19.} Den nedenfor beskrevne fremgangsmåde er også blevet anvendt med fibronectin (Fn) overtrukne perler til at karakterisere de signalveje nedstrøms fra spændinger påført integriner ^3. I denne undersøgelse Guilluy et al. viste, at spændinger aktiverer RhoA gennem ansættelse af de to guanin nukleotid exchange faktorer (GEFs), Larg og GEF-H1, til integrin vedhæftning komplekser. Siden da, har andre undersøgelser vist, at GEF-H1 rekrutteres til vedhæftning komplekser som reaktion på celle-genereret spænding ved hjælp af forskellige metoder ^{20, 21,} viser robustheden af metoden beskrevet her. Som følge heraf blev aktiveret RhoA vist at fremme adhæsion forstærkning, gennem cytoskeletal remodeling. Dette system blev også anvendt til at undersøge spænding, der påføres to celle / celleadhæsionsreceptorer. Anvendelse af kræfter på magnetiske perler overtrukket med det ekstracellulære domæne af E-cadherin inducerede en forøgelse af vinculin rekruttering lighed med integrin associeret adhæsionskomplekser ^12. Collins og kolleger observeret, at anvendelsen af spænding til PECAM-1 fremmer integrin og RhoA aktivering ^13. En anden eksperimenterende tilgang med magnetiske perler er studiet af spænding anvendes på isolerede kerner. Brug af perler overtrukket med antistoffer mod nukleare kappeproteinet nesprin-1 blev envelope komplekser nukleare oprenset for at vise, at de dynamisk reguleres som respons på mekanisk spænding ^22. Disse resultater understøtter powerfulness af denne metode i studiet af mechanotransduction pathways. Desuden mens flow eller trækkraft systemer stimulere generelle cellulære processer, magnetiske perler specifikt retter sig mod en celle vedhæftning receptor ved hjælp af enten ligander <sup class = "xref"> 3 eller monoklonale antistoffer mod celleoverfladereceptor ^{13, 15.}

En anden fordel ved denne fremgangsmåde er isolering af adhæsionskomplekser gennem en enkel ligandaffinitet oprensningsprocedure. Det er velkendt, at tilsætning af ligand-coatede perler til celler binder adhæsionsreceptorer og inducerer rekruttering af flere adhæsionsproteiner ^23. Yderligere anvendelse af kræfter til ligand-coatede magnetiske perler forvandler disse vedhæftning komplekser i makromolekylære platforme, der formidler forskellige spændinger-afhængige signalveje ^{4, 24.} Cellelyse efterfulgt af perle koncentration på en magnet tillader isoleringen af ​​vedhæftning platforme. Andre metoder, der anvendes til at oprense adhæsionskomplekser er allerede blevet anvendt i adhærente celler. De kombinerer kemisk tværbinding for at bevare protein-protein interaktionerog en celle lysis trin vaskemiddel og shear flow eller lydbehandling ^{20, 21, 25, 26, 27, 28.} Det sidste trin er en samling af de resulterende ventrale plasmamembraner indeholder adhæsionskomplekser. I modsætning disse metoder, magnetiske perler tillader en større rensning niveau af celleadhæsion komplekser ved selektivt at målrette en specifik familie af adhæsionsreceptorer. Magnetiske perler er allerede blevet anvendt til at oprense adhæsionskomplekser i ikke-adhærente celler bundet til ligand-coatede mikroperler ^{29, 30.} Den nedenfor beskrevne efterligner biologiske situationer metode, hvor kraft påføres i en kort længere periode (sekunder til minutter). Derfor giver det et stærkt værktøj til at undersøge både den molekylære sammensætning af oprensede adhæsionskomplekser ogdownstream mekanosensitive-signalveje.

Her præsenterer vi en detaljeret forsøgsprotokol for at bruge magnetiske perler til at anvende trækkræfter vejgreb overfladeproteiner. En permanent neodym magnet placeres oven på dyrkningsskålen overflade. Polfladen af magneten er placeret i en højde på 6 mm, således at kraften på et enkelt 2,8 um magnetisk perle er konstant (ca. 30-40 pn) ^31. Varigheden af ​​spænding stimulation bestemmes af operatøren afhængigt af molekylet af interesse og dens tidsplan for aktivering. Celler endelig lyseres, adhæsionskomplekser oprenses ved perler separation under anvendelse af en magnet og biokemiske analyser behandles. Denne protokol omfatter udarbejdelse af ligand-coatede superparamagnetiske perler, og anvendelsen af ​​spænding gennem magnet efterfulgt af biokemiske analyser. Derudover tilbyder vi et repræsentativt udsnit af data, der viser, at spændingen anvendes på integrin-baserede adhesions inducerer vedhæftning remodellering og ændrer proteintyrosinphosphorylering.

Protocol

1. Ligand Konjugering til magnetiske perler Bemærk: Ligand konjugation udføres ved anvendelse superparamagnetiske tosyl–aktiverede perler med en 2,8 um diameter (stamopløsning koncentration 10 8 perler / ml, 30 mg perler / ml). Den følgende protokol er baseret på prøver af ca. 2 x 10 5 celler, som svarer til MRC-5-celler dyrket til 80% konfluens i en 60 mm vævskulturplade. Juster lydstyrken af ​​perler og reagenser i overensstemmelse hermed, hvis du bruger pla…

Representative Results

Den skematiske af teknikken er vist i figur 1a. Efter ligand konjugering, er magnetiske perler inkuberes med celler i 20 minutter, og derefter anvendes en permanent magnet til at anvende trækkræfter på ca. 30-40 pN for forskellige tidsrum. Figur 1b viser 2,8 um FN-belagte magnetiske kugler bundet til MRC5 celleadhæsionsreceptorer. Vasketrinnene af superparamagnetiske perler efter cellelysis er afgørende og bestemme graden af ​​oprensning. Mindst tre…

Discussion

Den her beskrevne fremgangsmåde er en enkel tilgang til at anvende spænding til celleoverflade adhæsionsreceptorer og tillade deres efterfølgende oprensning. Men nogle trin er afgørende for at udføre en effektiv vedhæftning rensning og potentiel optimering kan gøres afhængig af de målrettede adhæsionsreceptorer. Vi præsenterer potentielle problemer brugeren kan støde nedenfor.

Vi anvendte 2,8 um diameter magnetiske perler, men større perler kan anvendes, såsom 4,5 um diameter….

Materials

Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish)	K&J Magnetics, Inc	DX88-N52	grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick
Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish)	K&J Magnetics, Inc	D84PC-BLK	grade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated
Dynabeads M280 Tosylactivated	Thermofisher	14203	superparamagnetic beads
DynaMag-2 Magnet	Thermofisher	12321D
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141-5MG	Fibronectin from bovine plasma
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280-5MG
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1428-50MG	Bovine Apo-Transferrin
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906-500G
DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate	Life Technologies	31966-021	DMEM+GlutaMAX-I 500 ml
60*15 mm culture dish	Falcon	353004