कोशिका की सतह आसंजन, mechanotransduction में केंद्रीय हैं के रूप में वे यांत्रिक तनाव संचारित और संकेतन ऊतक homeostasis और विकास में शामिल रास्ते आरंभ करें। यहाँ, हम जैव रासायनिक मार्ग है कि तनाव के जवाब में सक्रिय कर रहे हैं विदारक, ligand लेपित चुंबकीय microbeads और आसंजन रिसेप्टर्स करने के लिए बल प्रयोग करने के लिए आवेदन एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे।
Mechanosensitive कोशिका की सतह आसंजन परिसरों कोशिकाओं वे अपने आसपास के यांत्रिक गुणों भावना के लिए अनुमति देते हैं। हाल के अध्ययनों से आसंजन स्थलों पर बल संवेदन अणुओं, और बल पर निर्भर प्रतिलेखन कारक है कि वंश विशेष जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने और प्ररूपी outputs ड्राइव दोनों की पहचान की है। हालांकि, जैव रासायनिक रास्ते में यांत्रिक तनाव परिवर्तित संकेतन नेटवर्क मायावी बनी हुई है। सिगनल कोशिका की सतह रिसेप्टर के लिए लागू यांत्रिक तनाव पर लगे हुए रास्ते का पता लगाने के लिए, superparamagnetic microbeads इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ हम कोशिका की सतह आसंजन प्रोटीन के लिए बलों को लागू करने के लिए चुंबकीय मोतियों का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इस दृष्टिकोण का प्रयोग, यह आसंजन ligand लिपटे मोतियों से जुड़ी परिसरों के चुंबकीय अलगाव द्वारा विभिन्न जैव रासायनिक दृष्टिकोण से न केवल बल पर निर्भर cytoplasmic संकेत दे रास्ते, लेकिन यह भी आसंजन remodeling जांच करने के लिए संभव है। इस प्रोटोकॉल ligand-सह की तैयारी भी शामिलपैदा superparamagnetic मोती, और के आवेदन जैव रासायनिक विश्लेषण के द्वारा पीछा तन्य बलों को परिभाषित। इसके अतिरिक्त, हम चाहते हैं कि तनाव इंटीग्रिन आधारित आसंजन के लिए आवेदन किया प्रदर्शन कर डेटा का एक प्रतिनिधि नमूने आसंजन remodeling से चलाता है और प्रोटीन tyrosine फोस्फोराइलेशन बदल प्रदान करते हैं।
Metazoa में, यांत्रिक तनाव इस तरह के प्रसार, भेदभाव और अस्तित्व 1, 2 के रूप में सेलुलर प्रक्रियाओं की एक बहुत बड़ी संख्या के विनियमन के माध्यम से ऊतक विकास और homeostasis निर्देशन। यांत्रिक तनाव बाह्य मैट्रिक्स से पैदा कर सकते हैं या पक्षपाती कोशिकाओं है, जो नमूना actomyosin सिकुड़ा मशीनरी है कि बाह्य मैट्रिक्स पर खींचती है और तनाव के प्रति संवेदनशील अणुओं के माध्यम से अपनी कठोरता जांच के माध्यम से अपने बाह्य वातावरण के द्वारा उत्पन्न की जा सकती है। तनाव के जवाब में, mechanosensitive आसंजन प्रोटीन गठनात्मक परिवर्तन है कि जटिल cascades संकेत ट्रिगर से गुजरना। बदले में, इन संकेत दे रास्ते कि बाह्य वातावरण के लिए सेलुलर व्यवहार समायोजित कर एक mechanoresponse शामिल प्रसार, भेदभाव और अस्तित्व आर्केस्ट्रा। ऐसी प्रक्रियाओं (मिनट के लिए सेकंड) एक अल्पकालिक समय अवधि में बसे जा सकता है जल्दी व्यवस्था के पाश पर वापस करने के लिए फ़ीड mechanosensitive संरचनाओं को संशोधित करके notransduction। उदाहरण के लिए, इंटीग्रिन आधारित adhesions रो GTPase की मध्यस्थता cytoskeletal remodeling 3, 4, 5 के माध्यम से तनाव के जवाब में सुदृढ़। समानांतर में, अन्य संकेत दे रास्ते घंटे और दिन आनुवंशिक प्रोग्राम है कि अंततः सेल भाग्य 6 प्रभाव को नियंत्रित करने के लिए अधिक सक्रिय कर रहे हैं। जबकि, कई अध्ययनों सेल नियतिवाद और रोग के विकास 1, 2 पर मैट्रिक्स कठोरता के प्रभाव पर प्रकाश डाला है, आसंजन की मध्यस्थता mechanotransduction की सटीक आणविक तंत्र अभी भी मायावी रहते हैं।
विभिन्न दृष्टिकोणों सेल व्यवहार पर सेल उत्पन्न बलों या बाहरी ताकतों प्रवाह प्रणाली, प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) -tension सेंसर 7 सहित, के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है,लड़की = "xref"> 8, आज्ञाकारी substrates 9, चुंबकीय चिमटी, ऑप्टिकल चिमटी 10 और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) 11। यहाँ हम विशिष्ट आसंजन रिसेप्टर्स के लिए लागू खिंचाव या तनाव बलों के जवाब में mechanotransduction रास्ते को चिह्नित करने superparamagnetic मोती का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। Superparamagnetic मोती कणों जब एक चुंबकीय क्षेत्र में रखा गया है कि reversibly आकृष्ट कर रहे हैं। एक बार एक विशिष्ट रिसेप्टर के लिए एक ligand के साथ लेपित, इन मोतियों बाह्य बल आवेदन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करते हैं। इस विधि के कई अध्ययनों से 3, 5, 12 से मान्य किया गया है – 17 और लाभ पेश काफी हद तक पक्षपाती कोशिकाओं पर जैव रासायनिक विश्लेषण की सुविधा के लिए। इसी तरह के कोलेजन लेपित चुंबकीय जैव रासायनिक विश्लेषण के बाद मोती का प्रयोग, जल्दी काम में वृद्धि की सूचना दीप्रोटीन tyrosine फोस्फोराइलेशन और तनाव 5, 18, 19 के जवाब में RhoA सक्रियण। नीचे वर्णित विधि भी इंटेग्रिन 3 के लिए लागू तनाव से नीचे की ओर संकेत दे रास्ते को चिह्नित करने फ़ाइब्रोनेक्टिन (एफ एन) लेपित मोतियों के साथ इस्तेमाल किया गया है। इस अध्ययन में, Guilluy एट अल। पता चला है कि तनाव दो गुआनिन न्यूक्लियोटाइड विनिमय कारकों (GEFs), LARG और जीईएफ-एच 1, इंटीग्रिन आसंजन परिसरों की भर्ती के माध्यम से RhoA को सक्रिय करता है। उस के बाद से, अन्य अध्ययनों से पता चला है कि जीईएफ-H1 विभिन्न तरीकों 20, 21 का उपयोग कर, कार्यप्रणाली यहाँ वर्णित की मजबूती का प्रदर्शन सेल उत्पन्न तनाव के जवाब में आसंजन परिसरों के लिए भर्ती किया गया है। नतीजतन, सक्रिय RhoA cytoskeletal remodeling के माध्यम से, आसंजन सुदृढीकरण बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया था। इस प्रणाली को भी लागू किया तनाव टी पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया थाओ सेल / सेल आसंजन रिसेप्टर्स। ई cadherin के बाह्य डोमेन इंटीग्रिन जुड़े आसंजन परिसरों 12 को इसी तरह से vinculin भर्ती में वृद्धि प्रेरित साथ लेपित चुंबकीय मोती पर बलों के आवेदन। कोलिन्स और उनके सहयोगियों PECAM-1 इंटीग्रिन बढ़ावा देता है और RhoA सक्रियण से 13 तनाव की है कि आवेदन मनाया। चुंबकीय मोतियों का उपयोग एक और प्रयोगात्मक दृष्टिकोण तनाव का अध्ययन पृथक नाभिक के लिए आवेदन किया है। परमाणु लिफाफा प्रोटीन nesprin -1 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ लिपटे मोतियों का उपयोग करना, परमाणु लिफाफा परिसरों को दिखाने के लिए कि वे गतिशील यांत्रिक तनाव 22 के जवाब में विनियमित रहे हैं शुद्ध किया गया। इन परिणामों के mechanotransduction रास्ते के अध्ययन में इस विधि का powerfulness समर्थन करते हैं। इसके अलावा, जबकि प्रवाह या कर्षण बल सिस्टम सामान्य सेलुलर प्रक्रियाओं को बढ़ावा, चुंबकीय मोती विशेष रूप से एक कोशिका आसंजन रिसेप्टर या तो रिसेप्टर ligands का उपयोग करके लक्ष्य <suपी वर्ग = "xref"> 3 या कोशिका की सतह रिसेप्टर 13, 15 के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी।
इस पद्धति का एक और लाभ यह एक सीधा ligand आत्मीयता शुद्धि प्रक्रिया के माध्यम से आसंजन परिसरों के अलगाव है। यह सर्वविदित है कि कोशिकाओं के लिए ligand लिपटे मोतियों के अलावा आसंजन रिसेप्टर्स बांधता है और कई आसंजन प्रोटीन 23 की भर्ती लाती है। Ligand लेपित चुंबकीय मोतियों के लिए बलों के आगे आवेदन macromolecular प्लेटफॉर्म है कि विभिन्न तनाव पर निर्भर संकेत दे रास्ते 4 मध्यस्थता, 24 में इन आसंजन परिसरों बदल जाता है। सेल एक चुंबक का उपयोग मनका एकाग्रता के द्वारा पीछा आसंजन प्लेटफार्मों के अलगाव परमिट। आसंजन परिसरों को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल अन्य तरीकों पहले से ही पक्षपाती कोशिकाओं में इस्तेमाल किया गया है। वे प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के संरक्षण के लिए रासायनिक crosslinking गठबंधनऔर डिटर्जेंट और कतरनी प्रवाह या sonication 20, 21, 25, 26, 27, 28 से एक सेल कदम है। अंतिम चरण के आसंजन परिसरों युक्त जिसके परिणामस्वरूप उदर प्लाज्मा झिल्ली का संग्रह है। इन विधियों के विपरीत, चुंबकीय मोती चुनिंदा आसंजन रिसेप्टर्स की एक विशिष्ट परिवार को निशाना द्वारा कोशिका आसंजन परिसरों का एक बड़ा शुद्धि स्तर अनुमति देते हैं। चुंबकीय मोती पहले से ही गैर-पक्षपाती ligand लेपित microbeads 29, 30 से जुड़ी कोशिकाओं में आसंजन परिसरों को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। विधि mimics जैविक स्थितियों नीचे वर्णित है, जहां सेना के एक छोटे से निरंतर अवधि (मिनट के लिए सेकंड) के लिए आवेदन किया है। इसलिए, यह दोनों शुद्ध आसंजन परिसरों की आणविक संरचना की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है औरनीचे की ओर mechanosensitive-संकेत दे रास्ते।
यहाँ हम आसंजन सतह प्रोटीन के लिए खिंचाव या तनाव बलों लागू करने के लिए चुंबकीय मोतियों का उपयोग के लिए एक विस्तृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। एक स्थायी neodymium चुंबक संस्कृति पकवान सतह के शीर्ष पर रखा गया है। चुंबक की पोल चेहरे 6 मिमी की ऊंचाई पर रखा गया है, ताकि एक भी 2.8 माइक्रोन चुंबकीय मनका पर बल निरंतर (लगभग 30-40 पीएन) 31 है। तनाव उत्तेजना की अवधि के लिए ब्याज और सक्रियण के अपने समय के पैमाने का अणु के आधार पर ऑपरेटर द्वारा निर्धारित किया जाता है। प्रकोष्ठों अंत में lysed रहे हैं, आसंजन परिसरों एक चुंबक का उपयोग मोती जुदाई से शुद्ध कर रहे हैं और जैव रासायनिक विश्लेषण कार्रवाई कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल ligand लेपित superparamagnetic मोतियों की तैयारी, और जैव रासायनिक विश्लेषण के द्वारा पीछा चुंबक के माध्यम से तनाव के आवेदन भी शामिल है। इसके अतिरिक्त, हम चाहते हैं कि तनाव का प्रदर्शन डेटा का एक प्रतिनिधि नमूने इंटीग्रिन आधारित ADH के लिए लागू प्रदानesions आसंजन remodeling लाती है और प्रोटीन tyrosine फोस्फोराइलेशन बदल।
विधि यहाँ वर्णित कोशिका की सतह आसंजन रिसेप्टर्स करने के लिए तनाव लागू करते हैं और उनके बाद शुद्धि की अनुमति के लिए एक स्पष्ट दृष्टिकोण का गठन किया। हालांकि, कुछ चरणों को पूरा करने के लिए कुशल आसंजन शुद?…
The authors have nothing to disclose.
तटरक्षक एजेसीं राष्ट्रीय डी ला Recherche (ANR-13-JSV1-0008), यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम से (मैरी क्यूरी कैरियर एकता n˚8304162) से और यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) यूरोपीय संघ के क्षितिज के नीचे से अनुदान द्वारा समर्थित है 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (ईआरसी शुरू अनुदान n˚639300)।
Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | DX88-N52 | grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick |
Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | D84PC-BLK | grade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated |
Dynabeads M280 Tosylactivated | Thermofisher | 14203 | superparamagnetic beads |
DynaMag-2 Magnet | Thermofisher | 12321D | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | Fibronectin from bovine plasma |
Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | |
Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1428-50MG | Bovine Apo-Transferrin |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate | Life Technologies | 31966-021 | DMEM+GlutaMAX-I 500 ml |
60*15 mm culture dish | Falcon | 353004 |