模拟卵巢癌多细胞球体行为动态三维微型腹膜
1School of Biological Sciences,University of Hong Kong, 2Department of Mechanical Engineering,University of Hong Kong, 3Department of Medicine,University of Hong Kong, 4Department of Biomedical Sciences, Key Laboratory of Biochip Technology, Biotech and Health Centre,Shenzhen Research Institutes of City University of Hong Kong
Summary
为了研究卵巢肿瘤进展的生理相关的模型，多细胞球体下模拟流体流动的微型培养。这种动态3D模型模拟与在卵巢癌转移发生的细胞和机械部件的腹膜内环境。
Abstract
卵巢癌的特征在于丰富的腹膜转移，与恶性腹水通常发现肿瘤球。这与不良临床预后相关，目前缺乏有效的治疗方法。两个三维（3D）环境和动态机械力在此转移级联非常重要的因素。然而，传统的细胞培养不能概括这个自然肿瘤微环境。因此， 在体内样，可以效仿腹腔内环境模型的重要性显而易见。在这项研究中，腹膜的一个新的微流体平台成立转移期间以模仿卵巢癌的球体的情况在腹膜腔。一个非粘附的条件下生成的卵巢癌的球体均涂覆有经受生理学相关的剪切应力腹膜间皮细胞微流体通道中培养。总之，这个动态三维卵巢癌，间皮麦克风rofluidic平台可以在基本的癌症生物学提供了新的知识，并作为潜在的药物筛选和开发平台。
Introduction
卵巢癌是最致命的妇科肿瘤，其特征是广泛腹膜扩散和恶性腹水1的形成。这种广泛的腹膜转移是一项重大的临床挑战，并与较差的临床结果有关。不同于通过血液转移最坚实癌，卵巢癌主要是腹腔内传播。肿瘤细胞转移2的过程中，存在作为多细胞聚集体/球体。即悬浮培养能丰富卵巢癌干/肿瘤起始细胞，这一事实进一步表明，这些球体可能与两个肿瘤侵袭性相关联，并增强化疗3,4。有在2D和3D培养，这大概有不同的分子机制5之间药物的反应差异。
_content“>与间皮的基本相互作用构造为卵巢肿瘤进展的主要微环境，这些皮细胞躺在的胞外基质（ECM），其中纤连蛋白是一种普遍存在的组分。间皮细胞衍生纤连蛋白的表达和增加之间的链接肿瘤进展已经表明，纤维粘连蛋白是在恶性腹水6,7大量存在。卵巢癌细胞也能够诱导从间皮细胞纤连蛋白的分泌，以促进早期卵巢癌转移8。新出现的证据表明，机械性刺激，包括剪切应力，可以调节细胞形态，基因表达，并且因此，肿瘤细胞9，10，11的表型。由于恶性腹水 开发和t内积聚umor进展，卵巢肿瘤细胞暴露于流体流，将所得的剪切应力。若干组，我们包括，已显示出剪切应力对卵巢癌的进展的影响，包括细胞骨架修饰，上皮至间质转变，和癌症干性12，13，14，15。因此，生理相关微环境是肿瘤腹膜转移的调查重要。然而，目前的体外流体力学培养系统对模拟和控制常数，低，生理学相关的剪切应力16，17，18，19限制。 常规体外方法侧重于无论是蜂窝或机械环境依然有限模仿适当生理相关的腹腔微环境的复杂性。
这里，为了工程师腹膜一个新的模型，以克服常规的策略的限制，以推进在癌转移腹膜内室的研究中，以控制流体流动的基于3D微流体平台的设计。在这个模型中，卵巢癌球体分别与在微流控芯片在连续的流体流动（ 图 1A）的原代人腹膜间皮细胞共培养。铺板于纤连蛋白的间皮细胞。非粘附性卵巢癌球状体接种到用由注射泵灌注连续流动介质的微流体通道。两个3D环境和动态机械力转移级联的非常重要的因素。此平台可用于在复杂的CEL方面调查腹膜内微细胞性和共培养的相互作用，以及关于动态力学线索。
Protocol
1.微流体器件设计和制造微流控大师设计设计并绘制与任何计算机辅助设计（CAD）软件的微流体通道模式。 注意：通常情况下，该CAD绘图可以被发送到光掩模公司生产的光掩模。微流体设计包括三个相同的平行通道，每个通道具有以下尺寸为4mm×25毫米×250微米（宽度×长度×高度），并设置2mm的。两个信道两端分别设计有127°的角度，以促进液体的入口和出口（ 图1B）。</st…
Representative Results
使用该协议，一个微流体平台的成立，卵巢癌的球体水动力条件下的间皮细胞模型。原代人腹膜间皮细胞在微型装置中培养16小时，明视场显微镜下观察。 如图2A所示，通道底部被成功覆盖着的HPMC的单层。要注意的纤连蛋白或HPMC图案形成过程中气泡的形成会导致信道涂层失败是重要的。通过非粘附悬浮培养，直径大约为100微米，这是在大小中的那些患者的腹?…
Discussion
该测定提供了一个灵活的和生理学相关模型，可以与各种生物化学和基于细胞的测定，包括被结合，但不限于，粘附测定，间皮间隙测定法，和药物筛选。它可以应用到的腹腔微环境对癌症发展的效果的评估。然而，一些实验条件可能需要进行优化，这取决于计划的目标（ 例如，每信道，共培养时间等接种的HPMC和癌症球体的数量）。在腹膜内微环境的其它细胞类型，诸如成纤维细?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由香港研究资助局的支持（赠款17122014，C1013-15G，719813E和17304514）。 AST皇裘槎高级研究奖学金的获得者。
Materials
| Silicon wafer | University wafer | #1196 | 100mm |
| SU-8 2075 photoresist | Microchem | ||
| SU-8 developer | Microchem | 108-65-6 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 1673921 | Polydimethylsiloxane (PDMS) + curing agent kit |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31AA | 1 mm diameter |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Polyethylene tubing | SCI | BB31695-PE/5 | 0.86mm (inner diameter) |
| Syringe | Terumo | ||
| Syringe pump | Longer precision pump | LSP01-2A | |
| Medium 199 | Invitrogen | 31100-035 | Add 2.2g/L sodium bicarbonate |
| MCDB 105 Medium | Sigma | M6395 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30068.02 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Trypsin EDTA solution | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin -0.01% EDTA, phenol red |
| Fibronectin human | BD | 354008 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| 5-chloromethylfluorescein diacetate | Life technologies | C7025 | Green CMFDA |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-18AIC | |
| Centrifuge | Hitachi | CT15RE | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Model: 80i or ECLIPSE Ti; software: SPOT | |
| SKOV-3 | Gift from Dr. N Auersperg (University of British Columbia) |
References
- Jemal, A., et al. Global cancer statistics. CA: Cancer J. Clin. 61, 69-90 (2011).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Chau, W. K., Ip, C. K., Mak, A. S., Lai, H. C., Wong, A. S. c-Kit mediates chemoresistance and tumor-initiating capacity of ovarian cancer cells through activation of Wnt/beta-catenin-ATP-binding cassette G2 signaling. Oncogene. 32, 2767-2781 (2013).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).
- Tang, M. K. S., Zhou, H. Y., Yam, J. W. P., Wong, A. S. T. c-Met overexpression contributes to the acquired apoptotic resistance of nonadherent ovarian cancer cells through a cross talk mediated by phosphatidylinositol 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase 1/2. Neoplasia. 12, 128-144 (2010).
- Ksiazek, K., et al. Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin. Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).
- Hafter, R., Klaubert, W., Gollwitzer, R., Vonhugo, R., Graeff, H. Crosslinked Fibrin Derivatives and Fibronectin in Ascitic Fluid from Patients with Ovarian-Cancer Compared to Ascitic Fluid in Liver-Cirrhosis. Thromb Res. 35, 53-64 (1984).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307, 58-62 (2005).
- Chang, S. F., et al. Tumor cell cycle arrest induced by shear stress: Roles of integrins and Smad. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 3927-3932 (2008).
- Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator. Trends Cell Biol. 17, 44-50 (2007).
- Rizvi, I., et al. Flow induces epithelial-mesenchymal transition, cellular heterogeneity and biomarker modulation in 3D ovarian cancer nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, E1974-E1983 (2013).
- Ip, C. K., et al. Stemness and chemoresistance in epithelial ovarian carcinoma cells under shear stress. Sci. Rep. 6, 26788 (2016).
- Avraham-Chakim, L., et al. Fluid-flow induced wall shear stress and epithelial ovarian cancer peritoneal spreading. PloS one. 8, e60965 (2013).
- Burkhalter, R. J., et al. Peritoneal mechanobiology and metastatic success in epithelial ovarian cancer. Faseb Journal. 26, (2012).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Botta, G. P., Manley, P., Miller, S., Lelkes, P. I. Real-time assessment of three-dimensional cell aggregation in rotating wall vessel bioreactors in vitro. Nat. Protoc. 1, 2116-2127 (2006).
- Ismadi, M. Z., et al. Flow characterization of a spinner flask for induced pluripotent stem cell culture application. PloS one. 9, e106493 (2014).
- Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PloS one. 9. 9, e89966 (2014).
Cite This Article
Li, S., Ip, C. K. M., Tang, M. Y. H., Sy, S. K. H., Yung, S., Chan, T., Yang, M., Shum, H. C., Wong, A. S. Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice. J. Vis. Exp. (120), e55337, doi:10.3791/55337 (2017).