דוגמנות התנהגות אליפטית סרטן השחלות תאיים בתוך Microdevice הצפק 3D דינמי
Summary
כדי ללמוד התקדמות גידול שחלות במודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, spheroids רב-תאיים היו בתרבית microdevice תחת זרימת נוזל מדומה. מודל 3D דינמיקה זו מחק את סביבת intraperitoneal עם המרכיבים התאיים מכאניים שבו גרורות סרטן השחלות מתרחשות.
Abstract
סרטן השחלות מאופיין גרורות הצפק נרחבות, עם תחומי גידול נפוץ למצוא את מיימת הממאיר. זה קשור ותוצאות קליניות דלות וכיום חסר טיפול יעיל. הן בסביבה תלת-ממדי (3D) ואת הכוחות המכאניים דינאמיים הם גורמים חשובים מאוד מפל גרורה זה. עם זאת, תרביות תאים מסורתיות מצליחות לשחזר microenvironment גידול הטבעי הזה. לפיכך, in vivo מודלים-כמו שיכול לחקות את סביבת intraperitoneal הם בעלי חשיבות ברורה. במחקר זה, פלטפורמת microfluidic חדשה של הצפק הוקמה כדי לחקות את המצב של spheroids סרטן שחלות, בתוך חלל הבטן במהלך גרורות. spheroids השחלות סרטן שנוצר תחת מצב לא חסיד היה מתורבת ערוצי microfluidic מצופה תאים mesothelial הצפק נתון ללחץ גזירה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. לסיכום, מיקרופון הסרטן-mesothelium שחלות 3D דינמי זהפלטפורמת rofluidic יכולה לספק ידע חדש על ביולוגית סרטן בסיסית לשמש פלטפורמה להקרנה ופיתוח תרופות פוטנציאליות.
Introduction
סרטן השחלות הוא הסרטן הקטלני ביותר גניקולוגיות ומאופיין הפצת הצפק נפוצה להיווצרות מיימת ממאיר 1. גרורות הצפק ענפות זו מהווה אתגר קליני מהותי והיא קשורה עם תוצאות קליניות עניות. בניגוד לרוב קרצינומות מוצקים כי גרורות דרך הדם, סרטן השחלות מפיץ בעיקר בתוך חלל הצפק. תאים סרטניים קיימים אגרגטים רב-תאיים כמו / spheroids בתהליך של גרורות 2. העובדה שהתרבות ההשעיה יכול להעשיר גזע סרטניים בשחלות / תאים ייזום גידולים עוד עולה כי spheroids אלה עשויה להיות קשורה הן אגרסיביות הגידול ומשופרים chemoresistance 3, 4. ישנם הבדלים בתגובת סמים בין תרבויות 2D and 3D, אשר מן הסתם יש מנגנונים מולקולריים שונים 5.
_content "> האינטראקציה החיונית עם mesothelium בונה במייקרו-הסביבה העיקרית התקדמות גידול שחלות. תאי mesothelial אלה לשקר על תאי מטריקס (ECM), שבו פיברונקטין הוא מרכיב בכל מקום. קשר סיבתי בין הביטוי המוגבר של פיברונקטין תאים שמקורם mesothelial ו התקדמות גידול הוכח. פיברונקטין קיים בשפע מיימת ממאיר 6, 7. תאי סרטן השחלות יכול גם לגרום הפרשת פיברונקטין מתאי mesothelial כדי לקדם גרורות סרטן שחלות בשלב מוקדם 8.מתעוררים הראיות עולה כי גירויים מכניים, כולל מאמץ הגזירה, יכול לווסת מורפולוגיה תאים, ביטוי גנים, ולפיכך, פנוטיפים של תאים סרטניים 9, 10, 11. כמו מיימת ממאיר לפתח ולצבור במהלך tumor התקדמות, תאים סרטניים בשחלות נחשפים זרימת נוזל ואת לחץ הגזירה שהתקבל. מספר הקבוצות, שלנו כלל, מראה את ההשפעה של לחץ גזירה על התקדמות סרטן שחלות, כולל שינויי cytoskeleton, אפיתל-to-mesenchymal מעברים, וסרטן stemness 12, 13, 14, 15. לפיכך, microenvironment רלוונטי מבחינה פיזיולוגית חשוב לחקירת גרורות הצפק גידול. עם זאת, נוכחית במבחנת מערכות תרבות הידרודינמית יש מגבלות על מחקת ושליטת מאמץ גזירה קבועה, נמוך, רלוונטי מבחינה פיזיולוגית 16, 17, 18, 19. קונבנציונלי במבחנת גישות התמקדות משני הסביבה הסלולר או מכנה עדיין מוגבליםמחק את המורכבות של המיקרו-סביבת intraperitoneal עם הרלוונטיות פיסיולוגיות נכונות.
כאן, כדי להנדס מודל חדש של הצפק כדי להתגבר על המגבלות של אסטרטגיות קונבנציונליות כדי לקדם את המחקר של תא intraperitoneal בהתפשטות גרורה סרטני, פלטפורמת microfluidic המבוסס 3D עם זרימת נוזל נשלטה תוכנן. במודל זה, spheroids סרטן שחלות היו שיתוף תרבותי עם תאי mesothelial הצפק אדם מן המעלה ראשונים בתחום השבב microfluidic תחת זרם fluidic הרציף (איור 1 א). תאי mesothelial היו מצופים על פיברונקטין. spheroids לא חסיד סרטן השחלות היו זורעים לתוך ערוצי microfluidic עם המדיום זרימה רציפה perfused ידי משאבת מזרק. הן בסביבת 3D ואת הכוחות המכאניים דינאמיים הם גורמים חשובים מאוד של המפל גרורתי. פלטפורמה זו תוכל לשמש חוקר את המיקרו-סביבת intraperitoneal מבחינת cel מורכבlular ואינטראקציות שיתוף תרבות, כמו גם בכל הנוגע לרמזים מכאניים דינמיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
assay זה מציע מודל גמיש מבחינה פיזיולוגית רלוונטי שיכול להיות משולב עם מבחני ביוכימיים מבוססי תאים שונים, כולל, אך לא רק, מבחני הידבקות, מבחני אישור mesothelial, והקרנת התרופה. זה יכול להיות מיושם על הערכה של ההשפעה של microenvironment intraperitoneal על התקדמות סרטן. עם זאת, מספר תנאי ניסוי ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הונג קונג מענק מחקר המועצה (מענקים 17,122,014, C1013-15G, 719813E, ו 17,304,514). AST וונג הוא חתן מלגת המחקר הבכיר Croucher.
Materials
| Silicon wafer | University wafer | #1196 | 100mm |
| SU-8 2075 photoresist | Microchem | ||
| SU-8 developer | Microchem | 108-65-6 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 1673921 | Polydimethylsiloxane (PDMS) + curing agent kit |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31AA | 1 mm diameter |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Polyethylene tubing | SCI | BB31695-PE/5 | 0.86mm (inner diameter) |
| Syringe | Terumo | ||
| Syringe pump | Longer precision pump | LSP01-2A | |
| Medium 199 | Invitrogen | 31100-035 | Add 2.2g/L sodium bicarbonate |
| MCDB 105 Medium | Sigma | M6395 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30068.02 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Trypsin EDTA solution | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin -0.01% EDTA, phenol red |
| Fibronectin human | BD | 354008 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| 5-chloromethylfluorescein diacetate | Life technologies | C7025 | Green CMFDA |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-18AIC | |
| Centrifuge | Hitachi | CT15RE | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Model: 80i or ECLIPSE Ti; software: SPOT | |
| SKOV-3 | Gift from Dr. N Auersperg (University of British Columbia) |
References
- Jemal, A., et al. Global cancer statistics. CA: Cancer J. Clin. 61, 69-90 (2011).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Chau, W. K., Ip, C. K., Mak, A. S., Lai, H. C., Wong, A. S. c-Kit mediates chemoresistance and tumor-initiating capacity of ovarian cancer cells through activation of Wnt/beta-catenin-ATP-binding cassette G2 signaling. Oncogene. 32, 2767-2781 (2013).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).
- Tang, M. K. S., Zhou, H. Y., Yam, J. W. P., Wong, A. S. T. c-Met overexpression contributes to the acquired apoptotic resistance of nonadherent ovarian cancer cells through a cross talk mediated by phosphatidylinositol 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase 1/2. Neoplasia. 12, 128-144 (2010).
- Ksiazek, K., et al. Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin. Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).
- Hafter, R., Klaubert, W., Gollwitzer, R., Vonhugo, R., Graeff, H. Crosslinked Fibrin Derivatives and Fibronectin in Ascitic Fluid from Patients with Ovarian-Cancer Compared to Ascitic Fluid in Liver-Cirrhosis. Thromb Res. 35, 53-64 (1984).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307, 58-62 (2005).
- Chang, S. F., et al. Tumor cell cycle arrest induced by shear stress: Roles of integrins and Smad. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 3927-3932 (2008).
- Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator. Trends Cell Biol. 17, 44-50 (2007).
- Rizvi, I., et al. Flow induces epithelial-mesenchymal transition, cellular heterogeneity and biomarker modulation in 3D ovarian cancer nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, E1974-E1983 (2013).
- Ip, C. K., et al. Stemness and chemoresistance in epithelial ovarian carcinoma cells under shear stress. Sci. Rep. 6, 26788 (2016).
- Avraham-Chakim, L., et al. Fluid-flow induced wall shear stress and epithelial ovarian cancer peritoneal spreading. PloS one. 8, e60965 (2013).
- Burkhalter, R. J., et al. Peritoneal mechanobiology and metastatic success in epithelial ovarian cancer. Faseb Journal. 26, (2012).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Botta, G. P., Manley, P., Miller, S., Lelkes, P. I. Real-time assessment of three-dimensional cell aggregation in rotating wall vessel bioreactors in vitro. Nat. Protoc. 1, 2116-2127 (2006).
- Ismadi, M. Z., et al. Flow characterization of a spinner flask for induced pluripotent stem cell culture application. PloS one. 9, e106493 (2014).
- Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PloS one. 9. 9, e89966 (2014).
