Dinamik 3D Periton microdevice Modelleme Yumurtalık Kanseri Multisellüler Sfero Davranış
Summary
fizyolojik olarak ilgili model yumurtalık tümör progresyonunu incelemek için, çok hücreli küreler simüle sıvı akışı altında microdevice kültürlenmiştir. Bu dinamik 3D modeli yumurtalık kanseri metastazı meydana hücresel ve mekanik bileşenleri ile intraperitoneal ortamı benzetilmiştir.
Abstract
Yumurtalık kanseri sık malign asit bulunan tümör küreler ile geniş periton metastazı ile karakterizedir. Bu kötü klinik sonuçlarla ilişkili ve halen etkin bir tedavi yoksun. Hem üç boyutlu (3D) çevre ve dinamik mekanik kuvvetler bu metastatik kaskad çok önemli faktörlerdir. Ancak, geleneksel hücre kültürleri bu doğal tümör mikro özetlemek için başarısız. Böylece, periton ortamı taklit in vivo benzeri modeller belirgin öneme sahiptir. Bu çalışmada, periton yeni bir mikroakışkan platformu metastaz sırasında periton boşluğuna yumurtalık kanseri sferoidler durumu taklit etmek için kurulmuştur. Bir yapışkan olmayan koşullar altında üretilen Yumurtalık kanseri sferoidler fizyolojik olarak ilgili kesme stresine maruz periton mezotel hücreleri ile kaplanmış mikroakışkan kanal kültürlenmiştir. Özetle, bu dinamik 3D yumurtalık kanseri-Mesothelium mikrofonrofluidic platformu temel kanser biyolojisi üzerine yeni bilgi vermek ve potansiyel ilaç tarama ve geliştirme için bir platform olarak hizmet verebilir.
Introduction
Yumurtalık kanseri en ölümcül jinekolojik kanser ve yaygın periton yaygınlaştırılması ve malign asit 1 oluşumu ile karakterizedir. Bu geniş periton metastazı önemli bir klinik zorluk temsil eder ve kötü klinik sonuçlarla ilişkilidir. kan yoluyla metastaz en sağlam karsinom aksine, yumurtalık kanseri başta periton boşluğuna içinde yaymaktadır. Tümör hücreleri metastaz 2 sürecinde olduğu gibi çok hücreli agrega / parçacıklarının var. Süspansiyon kültürü yumurtalık kanseri kök / tümör başlatılması hücreleri zenginleştirmek gerçeği ayrıca bu sferoidler iki tümörün agresif oluş ile ilişkili olan ve kemoterapi direncinin 3, 4 gelişmiş olabileceğini düşündürmektedir. Muhtemelen farklı moleküler mekanizmaları 5 var 2D ve 3D kültürler arasındaki ilaç yanıt farklılıklar vardır.
_content "> mesothelium ile temel etkileşim yumurtalık tümörü ilerlemesi için temel mikro oluşturur. Bu mezotel hücre fibronektin bir yerde kurucu olan bir hücre dışı matriks (ECM), üzerinde yalan. artan mezotel hücre kaynaklı fibronektin ifadesi arasındaki bir bağlantıyı tümör ilerlemesi gösterilmiştir. fibronektin malign asit 6, 7 bol miktarda mevcuttur. yumurtalık kanseri hücreleri, erken yumurtalık kanseri metastazı 8 teşvik etmek için mezotel hücreleri fibronektin salgılanmasını uyarabildiği.Kanıtlar ortaya çıkan kesme stresi dahil olmak üzere, mekanik uyarı, hücre morfolojisi, gen ekspresyonunu modüle eden ve bu nedenle, tümör hücresi 9, 10, 11 fenotipleri göstermektedir. malign asit gibi geliştirmek ve t sırasında birikirumor ilerlemesi, yumurtalık tümör hücreleri sıvı akışı ve ortaya çıkan kesme stresine maruz kalır. Bir çok grup,, bizim dahil hücre iskeleti modifikasyonlar, epitelyal-to-mezenkimal geçişler ve kanser stemness 12, 13, 14, 15 dahil olmak üzere, yumurtalık kanser oluşumunu kesme stresi etkilerini göstermiştir. Böylece, fizyolojik olarak ilgili mikro-tümör periton metastazı araştırmak için önemlidir. Bununla birlikte, mevcut in vitro hidrodinamik kültür sistemleri sürekli, düşük, fizyolojik ilgili kayma gerilmesi 16, 17, 18, 19 taklit ve kontrol sınırlamalar var. Vitro geleneksel hala sınırlıdır hücresel veya mekanik çevre ya odaklanan yaklaşımlarUygun fizyolojik alaka ile intraperitoneal mikroçevresinin karmaşıklığını taklit.
Burada, geleneksel stratejilerin sınırlamaları aşmak için ve kanser metastazı intraperitoneal bölmesinin çalışma ilerlemek için periton yeni bir model mühendisi için, kontrollü sıvı akışı ile 3D mikroakışkan tabanlı bir platform dizayn edilmiştir. Bu modelde, yumurtalık kanseri sferoidler, sürekli akışkan akışı (Şekil 1A) altında mikroakışkan fiş primer insan periton mezotel hücreleri ile birlikte kültürlendi. mezotel hücreleri fibronektin ekildi. Yapışkan olmayan yumurtalık kanseri sferoidler bir şırınga pompası ile perfüze sürekli akış ortamı ile mikroakışkan kanal içine ekilmiştir. 3D çevre ve dinamik mekanik kuvvetlerin hem metastatik kaskad çok önemli faktörlerdir. Bu platform, karmaşık cel açısından intraperitonal mikro-araştırmak için kullanılabiliryanı sıra, dinamik mekanik işaretlere ilişkin lular ve ortak kültürlenme etkileşimi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu deney, yapışma tahlilleri, mezotel klirensi deneyleri, ve bunların ilaç tarama, bunlarla sınırlı olmamak üzere, çeşitli biyokimyasal ve hücre bazlı deneyler, ile dahil, ancak esnek bir ve fizyolojik açıdan ilgili bir model sunmaktadır. Bu kanser oluşumunu intraperitonal mikro etkisinin değerlendirilmesi için uygulanabilir. Ancak, birkaç deneysel koşullar projenin amaçları bağlı optimize edilmesi gerekebilir (örneğin, kanal, ko-kültür zaman, vb başına ekildi HPMCs ve kan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Hong Kong Araştırma Bursu Konseyi tarafından desteklenmiştir (hibe 17.122.014, C1013-15G, 719813E, ve 17304514). AST Wong Croucher Kıdemli Araştırma Bursu bir alıcı.
Materials
| Silicon wafer | University wafer | #1196 | 100mm |
| SU-8 2075 photoresist | Microchem | ||
| SU-8 developer | Microchem | 108-65-6 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 1673921 | Polydimethylsiloxane (PDMS) + curing agent kit |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31AA | 1 mm diameter |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Polyethylene tubing | SCI | BB31695-PE/5 | 0.86mm (inner diameter) |
| Syringe | Terumo | ||
| Syringe pump | Longer precision pump | LSP01-2A | |
| Medium 199 | Invitrogen | 31100-035 | Add 2.2g/L sodium bicarbonate |
| MCDB 105 Medium | Sigma | M6395 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30068.02 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Trypsin EDTA solution | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin -0.01% EDTA, phenol red |
| Fibronectin human | BD | 354008 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| 5-chloromethylfluorescein diacetate | Life technologies | C7025 | Green CMFDA |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-18AIC | |
| Centrifuge | Hitachi | CT15RE | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Model: 80i or ECLIPSE Ti; software: SPOT | |
| SKOV-3 | Gift from Dr. N Auersperg (University of British Columbia) |
References
- Jemal, A., et al. Global cancer statistics. CA: Cancer J. Clin. 61, 69-90 (2011).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Chau, W. K., Ip, C. K., Mak, A. S., Lai, H. C., Wong, A. S. c-Kit mediates chemoresistance and tumor-initiating capacity of ovarian cancer cells through activation of Wnt/beta-catenin-ATP-binding cassette G2 signaling. Oncogene. 32, 2767-2781 (2013).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).
- Tang, M. K. S., Zhou, H. Y., Yam, J. W. P., Wong, A. S. T. c-Met overexpression contributes to the acquired apoptotic resistance of nonadherent ovarian cancer cells through a cross talk mediated by phosphatidylinositol 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase 1/2. Neoplasia. 12, 128-144 (2010).
- Ksiazek, K., et al. Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin. Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).
- Hafter, R., Klaubert, W., Gollwitzer, R., Vonhugo, R., Graeff, H. Crosslinked Fibrin Derivatives and Fibronectin in Ascitic Fluid from Patients with Ovarian-Cancer Compared to Ascitic Fluid in Liver-Cirrhosis. Thromb Res. 35, 53-64 (1984).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307, 58-62 (2005).
- Chang, S. F., et al. Tumor cell cycle arrest induced by shear stress: Roles of integrins and Smad. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 3927-3932 (2008).
- Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator. Trends Cell Biol. 17, 44-50 (2007).
- Rizvi, I., et al. Flow induces epithelial-mesenchymal transition, cellular heterogeneity and biomarker modulation in 3D ovarian cancer nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, E1974-E1983 (2013).
- Ip, C. K., et al. Stemness and chemoresistance in epithelial ovarian carcinoma cells under shear stress. Sci. Rep. 6, 26788 (2016).
- Avraham-Chakim, L., et al. Fluid-flow induced wall shear stress and epithelial ovarian cancer peritoneal spreading. PloS one. 8, e60965 (2013).
- Burkhalter, R. J., et al. Peritoneal mechanobiology and metastatic success in epithelial ovarian cancer. Faseb Journal. 26, (2012).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Botta, G. P., Manley, P., Miller, S., Lelkes, P. I. Real-time assessment of three-dimensional cell aggregation in rotating wall vessel bioreactors in vitro. Nat. Protoc. 1, 2116-2127 (2006).
- Ismadi, M. Z., et al. Flow characterization of a spinner flask for induced pluripotent stem cell culture application. PloS one. 9, e106493 (2014).
- Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PloS one. 9. 9, e89966 (2014).
