Modellering Eggstokkreft Flercellede spheroid Opptreden i en dynamisk 3D Peritoneal Microdevice

Summary

For å studere ovarial tumor progresjon i et fysiologisk relevant modell, flercellede sfæroider ble dyrket i et microdevice henhold simulert fluidstrømmen. Denne dynamiske 3D-modell emulerer intraperitoneal miljø med de cellulære og mekaniske komponenter der eggstokkreft metastasering oppstår.

Abstract

Eggstokkreft er preget av omfattende peritoneal metastaser, med kreftkuler som vanligvis finnes i de ondartede ascites. Dette er forbundet med dårlige kliniske resultater, og for tiden mangler effektiv behandling. Både den tre-dimensjonale (3D) miljø, og de dynamiske mekaniske krefter er meget viktige faktorer i denne metastatic cascade. Men tradisjonelle cellekulturer klarer å rekapitulere denne naturlige svulstens mikromiljø. Dermed in vivo-lignende modeller som kan emulere intraperitoneal miljø er av åpenbar betydning. I denne studien ble en ny mikrofluid plattform av bukhinnen satt opp for å etterligne den situasjon av ovarialcancer sfæroider i bukhulen under metastase. Eggstokkreft kuler oppnådd under et ikke-klebende tilstand ble dyrket i microfluidic kanaler belagt med peritoneal mesothelial celler utsatt for fysiologisk relevant skjærspenning. Oppsummert, dette dynamiske 3D eggstokkreft-mesothelium microfluidic plattformen kan gi ny kunnskap om grunnleggende kreft biologi og tjene som en plattform for potensielle narkotika screening og utvikling.

Introduction

Eggstokkreft er den mest dødelige gynekologisk kreft og er preget av utbredt peritoneal formidling og dannelsen av ondartet ascites ^en. Denne omfattende peritoneal metastase representerer en stor klinisk utfordring og er assosiert med dårlig kliniske resultater. I motsetning til de fleste faste karsinomer som metastasize via blodet, eggstokk-kreft sprer primært innenfor bukhulen. Tumorceller eksistere som flercellede aggregater / kuler under prosessen med metastase ^to. Det faktum at suspensjonskultur kan berike eggstokkreft stilk / tumorceller initiere antyder videre at disse kuler kan være forbundet med både tumor aggressivitet og forbedret chemoresistance ^{3, 4.} Det er forskjeller i legemiddelrespons mellom 2D- og 3D-kulturer, som antakelig har forskjellige molekylære mekanismer ^5.

_content "> Den viktige samspillet med mesothelium konstruerer den primære mikromiljøet for eggstokkreft tumor progresjon. Disse mesothelial celler ligge på et ekstracellulært matriks (ECM), hvor fibronektin er en allestedsnærværende bestanddel. En kobling mellom økt uttrykk av mesothelial celle-avledet fibronektin og tumorprogresjon har blitt vist. fibronektin er rikelig tilstede i ondartet ascites ^{6, 7.} eggstokk-kreft-celler er også i stand til å indusere sekresjonen av fibronektin fra mesothelial celler for å fremme tidlig ovarian cancer metastase ^8.

Emerging bevis viser at mekaniske stimuli, inkludert skjærspenningen, kan modulere cellemorfologi, genekspresjon, og således fenotypene av tumorceller ^{9, 10, 11.} Som ondartet ascites utvikle og samle under tumor progresjon, blir ovarietumorceller utsatt for fluidstrømning, og den resulterende skjærspenning. Et antall grupper, våre inkludert, har vist virkningen av skjærspenning på progresjon av kreft i eggstokkene, inkludert cytoskjelett modifikasjoner, epitel-til-mesenchymale overganger og kreft stemness ^{12, 13, 14, 15.} Dermed er en fysiologisk relevant mikromiljøet viktig for etterforskningen av tumor peritoneal metastaser. Imidlertid, nåværende in vitro hydrodynamiske kultursystemer har begrensninger på å etterligne og styring av en konstant, lav, fysiologisk relevant skjærspenning ^{16, 17, 18, 19.} Konvensjonelle in vitro nærmer seg fokus på enten den cellulære eller mekanisk miljø er fortsatt begrenset iligne kompleksiteten av intraperitoneal mikromiljøet med passende fysiologisk relevans.

Her, for å konstruere en ny modell av peritoneum for å overvinne begrensninger av konvensjonelle strategier og for å fremme studiet av intraperitoneal rommet i kreftmetastaser, ble en 3D mikrofluid-basert plattform med kontrollert fluidstrømning utformet. I denne modellen eggstokkreft kuler samtidig var dyrket med primære humane peritoneal mesothelial celler i microfluidic chips under kontinuerlig fluidic flow (figur 1A). Mesothelial cellene ble sådd ut på fibronektin. Non-tilhenger eggstokkreft kuler ble sådd på microfluidic kanaler med kontinuerlig flyt medium dynket av en sprøytepumpe. Både 3D-miljøet og de dynamiske mekaniske krefter er svært viktige faktorer i den metastatisk kaskade. Denne plattformen kan benyttes for undersøkelse av intraperitoneal mikromiljøet i form av komplekse cellular og co-kultur interaksjoner, samt med hensyn til dynamiske mekaniske signaler.

Protocol

1. microfluidic enhet design og fabrikasjon Microfluidic mester utforming Design og trekke microfluidic kanal mønster med en hvilken som helst dataassistert konstruksjon (DAK) programvare. MERK: Normalt DAK-tegning kan sendes til en fotomaske selskap til å produsere fotomasken. Den microfluidic design består av tre identiske parallelle kanaler, hver med følgende dimensjoner: 4 mm x 25 mm x 250 mikrometer (bredde x lengde x høyde) og sette 2 mm fra hverandre. Begge kanalender ble utformet …

Representative Results

Ved hjelp av denne protokollen, ble en microfluidic plattform satt opp til å modellere eggstokkreft kuler med mesothelial celler under hydrodynamiske forhold. Primære humane peritoneale mesothelial celler ble dyrket i microdevice i 16 timer og observert under et sterkt mikroskop-felt. Som vist i figur 2A, ble kanalbunnen med hell belagt med et monolag av HPMCs. Det er viktig å merke seg at blæredannelse i løpet av fibronektin eller HPMC mønster vil føre til kanal …

Discussion

Denne analysen gir en fleksibel og fysiologisk relevant modell som kan bli inkorporert med forskjellige biokjemiske og cellebaserte analyser, inkludert, men ikke begrenset til, klebeanalyser, mesothelial klareringsanalyser, og medikament-screening. Den kan brukes til å evaluere effekten av intraperitoneal mikromiljøet på progresjon av kreft. Men kanskje flere eksperimentelle betingelser må være optimalisert, avhengig av målene for prosjektet (f.eks antall HPMCs og kreft kuler seeded per kanal, co-kulturen…

Materials

Silicon wafer	University wafer	#1196	100mm
SU-8 2075 photoresist	Microchem
SU-8 developer	Microchem	108-65-6
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane	Sigma	448931
Sylgard 184	Dow Corning	1673921	Polydimethylsiloxane (PDMS) + curing agent kit
Biopsy punch	Miltex	33-31AA	1 mm diameter
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-002
Polyethylene tubing	SCI	BB31695-PE/5	0.86mm (inner diameter)
Syringe	Terumo
Syringe pump	Longer precision pump	LSP01-2A
Medium 199	Invitrogen	31100-035	Add 2.2g/L sodium bicarbonate
MCDB 105 Medium	Sigma	M6395
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30068.02
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	15070-063
Trypsin EDTA solution	Gibco	25300-054	0.05% Trypsin -0.01% EDTA, phenol red
Fibronectin human	BD	354008
Agarose	Invitrogen	15510-027
5-chloromethylfluorescein diacetate	Life technologies	C7025	Green CMFDA
CO2 incubator	SANYO	MCO-18AIC
Centrifuge	Hitachi	CT15RE
Fluorescent microscope	Nikon		Model: 80i or ECLIPSE Ti; software: SPOT
SKOV-3			Gift from Dr. N Auersperg (University of British Columbia)