Multimer-PAGE: Ett förfarande för infångning och Lösa proteinkomplex i biologiska prover
Summary
Ett förfarande för stabilisering och separering nativa proteinkomplex från omodifierad vävnad lysat med användning av en amin-reaktivt protein tvärbindare kopplad till en ny tvådimensionell polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) system presenteras.
Abstract
Det finns många väl utvecklade metoder för att rena och studera enstaka proteiner och peptider. Dock är de flesta cellulära funktioner som utförs av nätverk av interagerande proteinkomplex, som ofta är svåra att undersöka eftersom deras bindning är icke-kovalent och lätt störs av reningstekniker. Detta arbete beskriver ett förfarande för stabilisering och separera nativa proteinkomplex från omodifierad vävnad med användning tvådimensionell polyakrylamidgelelektrofores. Vävnads lysatet laddades på en icke-denaturer blå-nativ polyakrylamidgel, då en elektrisk ström appliceras tills proteinet migrerar ett kort avstånd in i gelén. Gelén remsan innehållande den migrerade proteinet sedan ut och inkuberades med aminreaktiva tvärbindningsreagens ditiobis (succinimidylpropionat), vilka är kovalent stabiliserar proteinkomplex. Gelén remsa innehållande tvärbundna komplexen gjutes därefter in i en natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel, och than komplexen separeras helt. Metoden bygger på tekniker och material som är kända för de flesta molekylärbiologer, vilket betyder att den är billig och lätt att lära. Även om det är begränsad i sin förmåga att på lämpligt sätt skilja extremt stora komplex, och har inte varit allmänt framgångsrika metoden kunde fånga en mängd olika väl studerade komplex, och är sannolikt tillämplig på många system är av intresse.
Introduction
Normal cellulär funktion är beroende av protein-proteininteraktioner 1, 2. Som ett resultat, är humana sjukdomar ofta kännetecknas av störningar i montering och uppförande av olika proteinkomplex 3. Förmågan att karakterisera sådana interaktioner är därför kritisk. Nuvarande medel för att detektera dessa interaktioner kräver rening av målproteiner, ofta följt av neddragnings av deras samverkande partner. Konventionell rening åstadkoms genom differentiell centrifugering, utfällning, och / eller kromatografi 4. Dessa metoder är tidskrävande, måste ändras för varje målprotein, och resulterar ofta i låga utbyten. Moderna reningsmetoder involverar fusion av peptidmärkningar till målproteiner, följt av immunfällning eller extraktion på kolonner laddade med pärlor bundna till en infångningsmolekyl 5,"> 6. Även om detta är töjbart till många proteiner, det kräver sekvens modifiering av målet, kan resultera i konstruktioner som skiljer sig i affinitet för sina vanliga bindningspartners. Den känsliga naturen hos vissa protein-protein-interaktioner innebär denna metod kanske inte är tillämpliga många scenarier. Dessutom rullgardins analyser som används för att kartlägga protein-proteininteraktioner kan inte fånga en korrekt cellulär bild, på grund av begränsade frihetsgrader och främmande nivåer av betesproteinet.
Helst skulle proteinkomplex påvisas i deras infödda stater, utan behov av rening eller pull-down. Blå nativ polyakrylamidgelelektrofores (BN-PAGE) utvecklades som en mindre-denaturerande alternativ till natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE), och gör det möjligt för separation av vissa proteiner och komplex från biologiska prover 7. Emellertid proteiner i BN-PAGE separera baserad på en larGE antal variabler, inklusive storlek, laddning, tredimensionell struktur, och association med andra molekyler. Samverkan mellan dessa faktorer resulterar ofta i samtidig separation av proteiner, aggregatbildning och dålig proteinband upplösning. Tvådimensionell infödda polyakrylamidgelelektrofores löser en del, men inte alla, av dessa 8 problem.
Att kringgå de komplikationer i samband med nativt separation, vissa författare använder aminreaktiva tvärbindningsreagens, såsom ditiobis (succinimidylpropionat) (DSP), för att fånga proteinkomplex i vävnadslysat 4. Dessa behandlade lysat kan sedan denatureras och separerades genom SDS-PAGE, och samtidigt bevara den nativa storlek och makeup av proteinkomplex. Men eftersom tvärbindningsreagenser reagerar bygger på närhet av en molekyl till en annan, och proteiner i vävnads lysat har många frihetsgrader och kan stokastiskt interagera, ospecifik bakgrund kors-linking kan vara hög, särskilt i koncentrerade prover. Detta kan leda till svår tolka resultat.
Här visar vi användningen av en hybrid BN-PAGE / SDS-PAGE-metoden, benämnd multimer-polyakrylamidgelelektrofores (multimeren-PAGE), för att separera och detektera proteinaggregaten i komplexa blandningar. Initialt cellysat suspenderad i polyakrylamidgel via BN-PAGE. Lysatet innehållande gelén bringas sedan att reagera med tvärbindningsreagens DSP. Pseudo-immobiliseras och något separerade på gelén, proteiner är mycket mindre sannolikt att reagera ospecifikt, vilket innebär bakgrund tvärbindare reaktiviteten minskas. Efter tvärbindning, är de gelbanden skars ut och separeras via SDS-PAGE. Den erhållna gelén kan sedan analyseras på något sätt typiskt är associerade med polyakrylamidgelelektrofores. Denna metod tillåter för separation och detektion av nativa proteinkomplex i omodifierad vävnad lysat, utan behov av ytterligare rening eller pull-down.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protein-proteininteraktioner är viktiga för varje uppgift levande varelser genomföra. På grund av detta, de är föremål för intensiv granskning och forskning. Multimer-PAGE är en ny metod för att ta, separering, och analysera ett brett spektrum av proteinkomplex. Vi har tidigare visat sin tillämpbarhet på studera oligimerization av sjukdomen-associerat protein α-synuklein 11. Emellertid är det töjbara att många proteinkomplex, såsom visas i figur 2. Jämfört med …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Med stöd av NIH / NIDA DA034783. Vi tackar Bryan A. Killinger för tekniskt stöd med multimeren-PAGE.
Materials
| Chemicals | |||
| ε-Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic. |
| Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) | BioRad | 161-0148 | Toxic. |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti rabbit IgG-HRP from goat | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Bicinchoninic acid assay kit | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Chemiluminescence substrate kit | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D128-1 | |
| Dithiobis(succinimidylpropionate) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Dry nonfat milk | LabScientific | M0841 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermofisher | 78430 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144SI-212 | For titration. Caustic. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | For PVDF membrane activation. Toxic. |
| Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| N,N'-methylenebisacrylamide | Acros Organics | 16479 | Toxic. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Polyvinylidene fluoride transfer membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 88265 | |
| SDS solution (10% w/v) | BioRad | 161-0416 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L37771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) | BioRad | 161-0798 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| ImageJ software | NIH | ||
| Synergy H1 microplate reader | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 2 mL dounce homogenizer | |||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Ultrasonic tissue homogenizer | Fisher Scientific | FB120220 |
References
- Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).
- Ho, Y., et al. Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry. Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Beisiegel, U. Protein Blotting. Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).
- Killinger, B. A., Moszczynska, A. Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis. Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).
- Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein. PLoS One. 8 (11), e81314 (2013).
- Wong, S. S. . Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , (1991).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).
- Peters, K., Richards, F. M. Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure. Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate). J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).
- Sun, F., et al. Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).
- Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
