多聚-PAGE：生物样品中的用于拍摄方法和解决蛋白复合体
Summary
一种用于稳定和使用胺反应性蛋白交联剂偶联到一种新颖的二维聚丙烯酰胺凝胶电泳分离未修饰的组织裂解物天然蛋白质复合物的方法（PAGE）系统被呈现。
Abstract
有许多用于净化和研究单个蛋白质和肽发达的方法。然而，大多数的细胞功能是由相互作用的蛋白复合物的网络，这往往是难以调查，因为它们的结合是非共价的，并通过纯化技术容易扰动进行。这项工作描述了稳定剂和使用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳从未经修饰的组织分离天然蛋白质复合物的方法。组织裂解液加载到非变性蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶，然后施加电电流，直到蛋白质迁移的短距离到凝胶。然后将含有已迁移蛋白质凝胶条带切出，并与该胺反应性交联剂二硫代双（丙酸琥珀酰亚胺酯），其共价稳定的蛋白复合物一起温育。然后将含有交联复合物的凝胶条带浇注成十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶，和叔他配合是完全分开的。该方法依赖于技术和最熟悉的分子生物学家的材料，这意味着它是价格低廉，简单易学。虽然在其充分分离非常大的复合能力是有限的，并没有受到普遍成功，该方法能够捕捉各种充分研究的复合物，并有可能适用于许多感兴趣的系统。
Introduction
正常细胞功能是依赖于蛋白质-蛋白质相互作用1,2。其结果是，人类疾病通常是由在不同的蛋白质复合物3的组件和行为的扰动标记。表征这种相互作用的能力因此，至关重要。检测这些相互作用电流的装置需要的靶蛋白，通常随后通过相互作用配偶的下拉的纯化。常规纯化通过差速离心，沉淀和/或色谱法4来实现的。这些方法是耗时的，必须改变用于每个靶蛋白，并经常导致低的产率。现代纯化方法涉及肽标签融合到靶蛋白，随后通过免疫沉淀或萃取上装载有结合于捕获分子5珠粒柱，“> 6，虽然这是可扩展到许多蛋白质，这需要目标的序列修饰，潜在地导致在亲和力差异，它们通常的结合配偶体的构建体。一些蛋白质-蛋白质相互作用的微妙特性意味着这种方法可能不适用许多方案。另外，用于映射蛋白质 – 蛋白质相互作用的下拉测定法可以不捕获准确蜂窝图片，由于受限制的自由度和诱饵蛋白的非天然的水平。
理想情况下，蛋白复合物能够在他们的原生状态进行检测，而不需要净化或下拉。蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）被开发作为变性少替代十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），并允许某些蛋白质和复合物从生物样品7的分离。然而，在BN-PAGE蛋白质分离的基础上LARGE数的变量，包括大小，电荷，三维结构，和关联与其他分子。这些因素的相互作用通常导致蛋白质的共分离，聚集体形成，差的蛋白质条带的分辨率。二维原生聚丙烯酰胺凝胶电泳解决了一些，但不是全部，这些问题8。
为了避开与天然分离相关的并发症，一些作者使用胺反应性的交联试剂，如二硫代双（琥珀酰亚胺丙酸酯）（DSP），以捕获蛋白复合物在组织裂解物4。然后将这些处理过的溶胞产物可变性，并通过SDS-PAGE分离，同时保持蛋白质复合物的天然大小和化妆。然而，由于交联试剂反应基于一个分子到另一个的接近度，以及在组织裂解液的蛋白质具有许多自由度，并且可以随机相互作用，非特异性背景交叉-linking可以是高的，尤其是浓缩的样品英寸这可能会导致难以解释结果。
在这里，我们证明了使用混合BN-PAGE / SDS-PAGE的方法，被称为多聚聚丙烯酰胺凝胶电泳（多聚-PAGE），以分离和复杂混合物中检测蛋白组件。最初，细胞裂解物通过BN-PAGE悬浮于聚丙烯酰胺凝胶。含溶胞产物 – 凝胶，然后用交联试剂DSP反应。伪固定，并略微在凝胶上分离，蛋白可能非特异性反应少得多，这意味着背景交联剂反应性降低。交联后，将凝胶条带切下并通过SDS-PAGE分离。将所得的凝胶然后可以通过典型地与聚丙烯酰胺凝胶电泳相关的任何手段进行分析。这种方法允许在未修饰的组织裂解物天然蛋白质复合物的分离和检测，而无需额外的纯化或上拉陶氏ñ。
Protocol
Representative Results
Discussion
蛋白质 – 蛋白质相互作用是每个任务万物开展重要。正因为如此，他们是严格审查和研究的课题。多聚-PAGE是用于捕获，分离，和分析广泛的蛋白复合物的新方法。之前我们已经证实其适用于研究疾病相关蛋白α突触核蛋白11 oligimerization。然而，它是可扩展到许多蛋白复合物，如在图2证实。当与学习蛋白复合物的其他方法，多聚-PAGE是因为它的简单和简洁的是有利的?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
由NIH / NIDA DA034783支持。我们感谢布赖恩·A·基兰热与多聚-PAGE技术援助。
Materials
| Chemicals | |||
| ε-Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic. |
| Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) | BioRad | 161-0148 | Toxic. |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti rabbit IgG-HRP from goat | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Bicinchoninic acid assay kit | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Chemiluminescence substrate kit | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D128-1 | |
| Dithiobis(succinimidylpropionate) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Dry nonfat milk | LabScientific | M0841 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermofisher | 78430 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144SI-212 | For titration. Caustic. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | For PVDF membrane activation. Toxic. |
| Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| N,N'-methylenebisacrylamide | Acros Organics | 16479 | Toxic. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Polyvinylidene fluoride transfer membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 88265 | |
| SDS solution (10% w/v) | BioRad | 161-0416 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L37771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) | BioRad | 161-0798 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| ImageJ software | NIH | ||
| Synergy H1 microplate reader | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 2 mL dounce homogenizer | |||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Ultrasonic tissue homogenizer | Fisher Scientific | FB120220 |
References
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