Multimer-PAGE: Un metodo per acquisire e risolvere i complessi proteici nei campioni biologici
Summary
Metodo per la stabilizzazione e la separazione complessi proteici nativi di lisato tessuto non modificato utilizzando una proteina reticolante amminico reattivo accoppiato ad un romanzo elettroforesi bidimensionale poliacrilammide sistema (PAGE) è presentato.
Abstract
Ci sono molti metodi ben sviluppati per purificare e studiare singole proteine e peptidi. Tuttavia, la maggior parte delle funzioni cellulari sono svolte da reti di interazione complessi proteici, che sono spesso difficili da studiare perché il loro legame non covalente e facilmente perturbato da tecniche di purificazione. Questo lavoro descrive un metodo per stabilizzare e separare complessi proteici nativi da tessuto non modificato usando elettroforesi bidimensionale poliacrilammide. Tessuto lisato viene caricato su un gel di poliacrilammide-blu nativa non denaturante, quindi una corrente elettrica viene applicata fino a quando la proteina migra a breve distanza nel gel. La striscia gel contenente la proteina migrato viene poi asportato e incubato con le ditiobis ammina reattiva reticolanti reagenti (succinimidil propionato), che stabilizza covalentemente complessi proteici. La striscia gel contenente complessi reticolati viene poi gettato in un gel di poliacrilammide sodio dodecil solfato, e tegli complessi sono separati completamente. Il metodo si basa su tecniche e materiali noti alla maggior parte dei biologi molecolari, che significa che è poco costoso e facile da imparare. Mentre è limitato nella sua capacità di separare adeguatamente estremamente grandi complessi, e non è stato universalmente successo, il metodo è stato in grado di catturare una vasta gamma di complessi ben studiato, ed è probabile applicabile a molti sistemi di interesse.
Introduction
Funzione cellulare normale dipende da interazioni proteina-proteina 1, 2. Come risultato, malattie umane sono spesso caratterizzate da perturbazioni nel montaggio e il comportamento di vari complessi proteici 3. La capacità di caratterizzare tali interazioni è quindi cruciale. attuali mezzi di rilevamento di queste interazioni richiedono purificazione di proteine target, spesso seguite da discesa dei loro partner interagenti. Purificazione convenzionale viene realizzata mediante centrifugazione differenziale, precipitazione e / o cromatografia 4. Questi metodi richiedono tempo, devono essere modificati per ogni proteina bersaglio, e spesso sfociano in basse rese. I moderni metodi di purificazione comporta la fusione di tag peptidici di proteine bersaglio, seguita da immunoprecipitazione o estrazione su colonne carichi di perline legati ad una molecola di cattura 5,"> 6. Mentre questo è estensibile per molte proteine, richiede sequenza modificazione del bersaglio, causando un potenziale costrutti che differiscono affinità per loro soliti partner di legame. La delicatezza di alcune interazioni proteina-proteina significa che questo metodo non può essere applicabile per molti scenari. Inoltre, i saggi di pull-down utilizzati per mappare le interazioni proteina-proteina possono non catturare un quadro preciso cellulari, a causa di gradi di libertà e limitato i livelli di non-native della proteina esca.
Idealmente, complessi proteici possono essere rilevati nei loro stati native, senza la necessità di depurazione o di pull-down. Blu nativo elettroforesi su gel di poliacrilammide (BN-PAGE) è stato sviluppato come meno denaturante alternativa sodio dodecil solfato elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE), e consente la separazione di alcune proteine e complessi da campioni biologici 7. Tuttavia, le proteine in BN-PAGE separate basate su una larnumero ge di variabili, tra cui le dimensioni, carica, struttura tridimensionale, e associazione con altre molecole. Le interazioni di questi fattori causano spesso co-separazione delle proteine, formazione di aggregati, e scarsa risoluzione banda proteica. Elettroforesi bidimensionale nativo-poliacrilammide risolve alcuni, ma non tutti, questi problemi 8.
Per aggirare le complicazioni associate con separazione nativo, alcuni autori utilizzano reagenti ammina reattiva reticolanti, come ditiobis (propionato succinimmidil) (DSP), per catturare complessi proteici in lisati di tessuto 4. Questi lisati trattati possono essere denaturate e separate mediante SDS-PAGE, preservando la dimensione originale e il trucco complessi proteici. Tuttavia, poiché i reagenti reticolazione reagiscono in base alla vicinanza di una molecola a un'altra, e le proteine nei lisati tissutali avere molti gradi di libertà e può stocasticamente interagire fondo non specifica croceIl legame può essere elevato, soprattutto nei campioni concentrati. Ciò può portare a risultati difficili da interpretare.
Qui dimostriamo l'utilizzo di un metodo ibrido BN-PAGE / SDS-PAGE, denominato elettroforesi multimer-poliacrilammide (multimer-PAGE), per separare e rilevare gruppi di proteine in miscele complesse. Inizialmente, il lisato cellulare viene sospeso in gel di poliacrilamide tramite BN-PAGE. Il gel contenente lisato viene quindi reagito con il reagente di reticolazione DSP. Pseudo-immobilizzato e leggermente separato sul gel, le proteine sono molto meno probabilità di reagire in modo non specifico, il che significa che la reattività di cross-linker di sfondo è ridotta. Dopo la reticolazione, le bande di gel vengono escise e separate mediante SDS-PAGE. Il gel risultante può quindi essere analizzato con qualsiasi mezzo tipicamente associato all'elettroforesi del gel di poliacrilammide. Questo metodo consente la separazione e la rilevazione di complessi proteici nativi in lisato tissutale non modificato, senza la necessità di ulteriori purificazione o tiraturan.
Protocol
Representative Results
Discussion
interazioni proteina-proteina sono importanti per ogni compito esseri viventi svolgono. A causa di questo, sono oggetto di intenso scrutinio e di ricerca. Multimero-PAGE è un nuovo metodo per l'acquisizione, la separazione e l'analisi di un'ampia gamma di complessi proteici. Abbiamo precedentemente dimostrato la sua applicabilità a studiare oligimerization della malattia associata proteina α-sinucleina 11. Tuttavia, è estendibile a molti complessi proteici, come mostrato nella <st…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sostenuto dalla DA034783 NIH / NIDA. Ringraziamo Bryan A. Killinger per l'assistenza tecnica con il multimero-PAGE.
Materials
| Chemicals | |||
| ε-Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic. |
| Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) | BioRad | 161-0148 | Toxic. |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti rabbit IgG-HRP from goat | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Bicinchoninic acid assay kit | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Chemiluminescence substrate kit | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D128-1 | |
| Dithiobis(succinimidylpropionate) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Dry nonfat milk | LabScientific | M0841 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermofisher | 78430 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144SI-212 | For titration. Caustic. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | For PVDF membrane activation. Toxic. |
| Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| N,N'-methylenebisacrylamide | Acros Organics | 16479 | Toxic. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Polyvinylidene fluoride transfer membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 88265 | |
| SDS solution (10% w/v) | BioRad | 161-0416 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L37771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) | BioRad | 161-0798 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| ImageJ software | NIH | ||
| Synergy H1 microplate reader | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 2 mL dounce homogenizer | |||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Ultrasonic tissue homogenizer | Fisher Scientific | FB120220 |
References
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