Multimer-PAGE: A Fremgangsmåde til registrering og Løsning proteinkomplekser i biologiske prøver
Summary
En fremgangsmåde til stabilisering og adskillelse native proteinkomplekser fra umodificeret væv lysat anvendelse af en amin-reaktivt protein tværbindingsmiddel koblet til en hidtil ukendt todimensional polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) system er vist.
Abstract
Der er mange veludviklede metoder til oprensning og studere enkelte proteiner og peptider. Men de fleste cellulære funktioner udføres af netværk af interagerende protein-komplekser, som ofte er vanskeligt at efterforske fordi deres binding er ikke-kovalent og let forstyrres af oprensningsteknikker. Dette arbejde beskriver en fremgangsmåde til stabilisering og adskillelse native proteinkomplekser fra umodificeret væv under anvendelse af todimensional polyacrylamidgelelektroforese. Tissue lysat påsat en ikke-denaturerende blå-nativ polyacrylamidgel, derefter en elektrisk strøm anvendes indtil proteinet migrerer en kort afstand ind i gelen. Gelen strimmel indeholdende det migrerede protein derpå udskåret og inkuberet med aminreaktive krydsbindingsreagens dithiobis (succinimidylpropionat), som covalent stabiliserer proteinkomplekser. Gelen strimmel indeholdende tværbundne komplekser derefter støbt i en natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel, og than komplekser adskilles fuldstændigt. Metoden bygger på teknikker og materialer er velkendte for de fleste molekylærbiologer, hvilket betyder at det er billigt og nemt at lære. Selv om det er begrænset i sin evne til i tilstrækkelig grad at adskille ekstremt store komplekser, og har ikke været universelt succes, metoden var i stand til at fange et bredt udvalg af velundersøgte komplekser, og er sandsynligvis gældende for mange systemer af interesse.
Introduction
Normal cellulær funktion er afhængig af protein-protein interaktioner 1 , 2 . Som følge heraf er menneskelige sygdomme ofte præget af forstyrrelser i samlingen og opførelsen af forskellige proteinkomplekser 3 . Evnen til at karakterisere sådanne interaktioner er derfor kritisk. Nuværende midler til at detektere disse interaktioner kræver rensning af målproteiner, ofte efterfulgt af nedtrængning af deres samspillende partnere. Konventionel oprensning udføres ved differentiel centrifugering, udfældning og / eller kromatografi 4 . Disse metoder er tidskrævende, skal ændres for hvert målprotein og resulterer ofte i lave udbytter. Moderne oprensningsmetoder involverer fusion af peptidmærker til målretning af proteiner efterfulgt af immunpræcipitation eller ekstraktion på søjler, der er fyldt med perler bundet til et fangsmolekyle 5 ,"> 6. Mens dette er strækbart for mange proteiner, kræver sekvens modifikation af målet, hvilket potentielt kan medføre konstruktioner, der afviger i affinitet for deres sædvanlige bindingspartnere. Den fine karakter af nogle protein-protein interaktioner betyder denne metode ikke kan anvendes til mange scenarier. Derudover pull-down assays anvendes til at kortlægge protein-protein-interaktioner kan ikke fange et nøjagtigt cellulær billede, på grund af begrænsede frihedsgrader og ikke-native niveauer af bait-proteinet.
Ideelt set kunne proteinkomplekser påvises i deres native tilstande, uden behov for oprensning eller pull-down. Blå nativ polyacrylamidgelelektroforese (BN-PAGE) blev udviklet som en mindre-denaturerende alternativ til natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE), og giver mulighed for adskillelse af visse proteiner og komplekser fra biologiske prøver 7. Imidlertid proteiner i BN-PAGE adskille baseret på en large antal variabler, herunder størrelse, ladning, tredimensionelle struktur, og association med andre molekyler. Interaktionerne af disse faktorer resulterer ofte i co-separation af proteiner, aggregatdannelse og dårlig proteinbånd opløsning. Todimensional nativ polyacrylamidgelelektroforese løser nogle, men ikke alle, af disse problemer 8.
At omgå de komplikationer forbundet med nativt separation, nogle forfattere anvender aminreaktive krydsbindingsreagenser, såsom dithiobis (succinimidylpropionat) (DSP), at indfange proteinkomplekser i vævslysater 4. Disse behandlede lysater kan derefter denatureres og adskilles ved SDS-PAGE, og samtidig bevare den native størrelse og makeup af proteinkomplekser. Men da krydsbindingsreagenser reagere ud fra nærhed af et molekyle til et andet, og proteiner i vævslysater har mange frihedsgrader og kan stokastisk interagere, specifik baggrund cross-linking kan være høj, især i koncentrerede prøver. Dette kan føre til svære at fortolke resultater.
Her demonstrerer vi brugen af en hybrid BN-PAGE / SDS-PAGE-metode, betegnet multimer-polyacrylamidgelelektroforese (multimer-PAGE) for at adskille og detektere proteinkonstruktioner i komplekse blandinger. I første omgang suspenderes cellelysat i polyacrylamidgel via BN-PAGE. Den lysatholdige gel omsættes derefter med tværbindingsreagens DSP. Pseudo-immobiliseret og lidt adskilt på gelen, er proteiner meget mindre tilbøjelige til at reagere uspecifikt, hvilket betyder, at baggrunds-tværbindingsreaktiviteten reduceres. Efter tværbinding udskilles gelbåndene og adskilles via SDS-PAGE. Den resulterende gel kan derefter analyseres på ethvert middel, der typisk er forbundet med polyacrylamidgelelektroforese. Denne metode muliggør adskillelse og påvisning af native proteinkomplekser i umodificeret vævsl lysat uden behov for yderligere rensning eller pull-down.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protein-protein interaktioner er vigtige for enhver opgave levende ting udfører. På grund af dette, de er genstand for en intens undersøgelse og forskning. Multimer-PAGE er en ny fremgangsmåde til indfangning, separering og analyse af en lang række af proteinkomplekser. Vi har tidligere vist sin anvendelighed til at studere oligimerization af den sygdomsassocierede protein α-synuclein 11. Det er dog udvides til mange proteinkomplekser, som vist i figur 2. Sammenlignet med a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Støttet af NIH / Nida DA034783. Vi takker Bryan A. Killinger til teknisk bistand med multimer-PAGE.
Materials
| Chemicals | |||
| ε-Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic. |
| Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) | BioRad | 161-0148 | Toxic. |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti rabbit IgG-HRP from goat | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Bicinchoninic acid assay kit | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Chemiluminescence substrate kit | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D128-1 | |
| Dithiobis(succinimidylpropionate) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Dry nonfat milk | LabScientific | M0841 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermofisher | 78430 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144SI-212 | For titration. Caustic. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | For PVDF membrane activation. Toxic. |
| Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| N,N'-methylenebisacrylamide | Acros Organics | 16479 | Toxic. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Polyvinylidene fluoride transfer membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 88265 | |
| SDS solution (10% w/v) | BioRad | 161-0416 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L37771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) | BioRad | 161-0798 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| ImageJ software | NIH | ||
| Synergy H1 microplate reader | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 2 mL dounce homogenizer | |||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Ultrasonic tissue homogenizer | Fisher Scientific | FB120220 |
References
- Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).
- Ho, Y., et al. Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry. Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Beisiegel, U. Protein Blotting. Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).
- Killinger, B. A., Moszczynska, A. Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis. Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).
- Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein. PLoS One. 8 (11), e81314 (2013).
- Wong, S. S. . Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , (1991).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).
- Peters, K., Richards, F. M. Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure. Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate). J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).
- Sun, F., et al. Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).
- Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
