Summary
Um método para estabilizar e separando complexos de proteína nativa a partir de lisado de tecido não modificado utilizando uma proteína de reticulação reactivo com amina ligado a uma electroforese em gel de poliacrilamida bidimensional novo sistema (PAGE) é apresentada.
Abstract
Existem muitos métodos bem desenvolvidos para purificar e estudar proteínas individuais e peptídeos. No entanto, a maioria das funções celulares são realizados por redes de complexos de proteínas que interagem, que são muitas vezes difíceis de investigar, porque a sua ligação é não-covalente e facilmente perturbado por técnicas de purificação. Este trabalho descreve um método de estabilização e separando complexos de proteína nativa a partir de tecido não modificado utilizando electroforese em gel de poliacrilamida bidimensional. lisado de tecido é carregado num gel de poliacrilamida nativo azul-n desnaturante, em seguida, uma corrente eléctrica é aplicada até que a proteína migra uma curta distância dentro do gel. A tira de gel contendo a proteína migrado é então excisada e incubadas com as ditiobis reactivos de amina reagente de ligação cruzada (propionato de succinimidilo), que estabiliza covalentemente complexos de proteínas. A tira de gel contendo complexos de ligação cruzada é então moldada num gel de poliacrilamida de sulfato de dodecilo de sódio, e tele complexos são separados completamente. O método baseia-se em técnicas e materiais familiares para a maioria dos biólogos moleculares, o que significa que é barato e fácil de aprender. Enquanto que é limitada na sua capacidade para separar adequadamente extremamente grandes complexos, e não tem sido universalmente bem sucedida, o método foi capaz de capturar uma grande variedade de complexos bem estudadas, e é provavelmente aplicável a muitos sistemas de interesse.
Introduction
Função celular normal é dependente de interacções proteína-proteína de 1, 2. Como resultado, as doenças humanas são frequentemente caracterizadas por perturbações na montagem e comportamento de vários complexos de proteínas 3. A capacidade de caracterizar essas interacções é, por conseguinte, crítica. meios actuais de detecção destas interacções requerem purificação de proteínas alvo, muitas vezes seguidos por suspenso de seus parceiros interactuantes. Clássica de purificação é realizado por centrifugação diferencial, precipitação e / ou cromatograf ia em 4. Estes métodos são demorados, deve ser alterado para cada proteína alvo, e muitas vezes resultam em baixos rendimentos. Modernos métodos de purificação envolvem a fusão de sinais peptídicos a proteínas alvo, seguido de imunoprecipitação ou de extracção em colunas carregadas com esferas ligadas a uma molula de captura 5,"> 6. Embora esta seja extensível para muitas proteínas, que exige modificação da sequência do alvo, potencialmente resultando em construções que diferem na afinidade para os seus parceiros de ligação usuais. A natureza delicada de algumas interacções proteína-proteína significa que este método pode não ser aplicável para muitos cenários. Além disso, os ensaios de pull-down utilizadas para mapear as interações proteína-proteína pode não capturar uma imagem celular precisa, devido à graus restritos de liberdade e os níveis de não-nativos da proteína isca.
Idealmente, os complexos de proteína podia ser detectada nos seus estados nativos, sem a necessidade de purificação ou suspenso. Electroforese em gel de poliacrilamida nativa azul (BN-PAGE) foi desenvolvido como uma alternativa menos desnaturante a electroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), e permite a separação de algumas proteínas e complexos a partir de amostras biológicas 7. No entanto, as proteínas em BN-PAGE separadas com base em um large número de variáveis, incluindo tamanho, carga, estrutura tridimensional, e associação com outras moléculas. As interacções destes factores resultam frequentemente em co-separação de proteínas, formação de agregados, e pobre resolução banda de proteína. Electroforese em gel nativo de poliacrilamida bidimensional resolve alguns, mas não todos, estes problemas 8.
Para contornar as complicações associadas com a separação nativa, alguns autores utilizam reagentes reactivos de amina de reticulao, tais como ditiobis (propionato de succinimidilo) (DSP), para capturar os complexos de proteína em lisados de tecido 4. Estes lisados tratados pode então ser desnaturado e separadas por SDS-PAGE, preservando ao mesmo tempo o tamanho nativo e a composição de complexos de proteínas. No entanto, uma vez que os reagentes de reticulação reagir com base na proximidade de uma molécula para outra, e proteínas em lisados de tecido tem muitos graus de liberdade e pode interagir estocasticamente, inespecífica transversal fundo-linking pode ser elevado, especialmente em amostras concentradas. Isso pode levar a resultados difíceis de interpretar.
Aqui, demonstramos a utilização de um método híbrido BN-PAGE / SDS-PAGE, denominada electroforese em gel de poliacrilamida-multero (multímero-PAGE), para separar e detectar os conjuntos de proteínas em misturas complexas. Inicialmente, lisado de células é suspenso em gel de poliacrilamida através BN-PAGE. O gel contendo o lisado é então feito reagir com o reagente DSP reticulação. e ligeiramente separadas no gel imobilizada-pseudo, as proteínas são muito menos susceptíveis de reagir de forma não específica, o que significa que a reactividade cruzada de fundo ligante é reduzida. Após a reticulação, as bandas de gel são excisadas e separados por meio de SDS-PAGE. O gel resultante pode então ser analisada por quaisquer meios tipicamente associados com electroforese em gel de poliacrilamida. Este método permite a separação e a detecção de complexos de proteínas nativas em lisado de tecido não modificada, sem a necessidade de purificação adicional ou puxar-Down.
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Protocol
1. Preparação do Tecido
- Preparar 10 ml de 4x tamp de amostra BN-PAGE (Bis 200 mM (2-hidroxietil) metano amino-tris (hidroximetil) (Bis-Tris), NaCl 200 mM, 40% w / v de glicerol, 0,004% de Ponceau S, pH 7,2 ).
NOTA: esta solução pode ser feita com antecedência e guardadas a 4 ° C. - Dilui-se 250 uL de tampão de amostra 4x em 750 uL de dH2O contendo mistura de inibidores de protease comercial 1x. Vortex e frio no gelo.
- Homogeneizar 20 mg de tecido alvo no tampão de amostra de 1 mL de 1x gelada BN-PAGE com 30 movimentos de um homogeneizador Dounce limpo.
NOTA: Para este experimento de demonstração, o tecido alvo é tecido cerebral de ratos todo. Ap homogeneizao, as amostras podem ser tratadas com detergente suave, tal como 2% de digitonina para solubilizar e permitir a electroforese de proteínas de membrana. - Transferir o homogeneizado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e centrifugar a 14000 xg durante 30 min para sedimentar os conteúdos celulares insolúveis. after centrifugação, decanta-se o sobrenadante para um tubo limpo em gelo.
- Seguir as instruções do fabricante para medir a concentração de proteína sobrenadante utilizando ácido bicinchonínico (BCA) ou um ensaio de quantificação de proteína semelhante.
- Se a amostra (s) de homogenado conter detergente, adicionar uma quantidade de 5% de Coomassie Blue G-250 em solução aquosa suficiente para levar a solução homogeneizado a 0,25% de Coomassie.
2. BN-PAGE
- Dilui-se 25 ml de 20x azul nativa (BN) electroforese estoque de tampão (1,0 M de Bis-Tris, 1,0 M de tricina, pH 6,8) em 475 mL de dH2O contendo 0,002% de Azul de Coomassie para fazer 500 ml de tamp de corrida 1x.
- Se as amostras contêm detergente, em vez disso fazer 250 ml de tamp de corrida 1x contendo 0,02% de Coomassie e mais 250 mL contendo nenhum.
- tampão (s) frio a 4 ° C.
- Limpar e montar um gel de poliacrilamida que derrama Cassete de acordo com as instruções do fabricante.
- Após a polimerização dos géis, enxágüe a cassete com dH2O e monte o aparelho de eletroforese de acordo com as instruções do fabricante.
- Remova o pente do poço e encha os poços com 1x buffer de execução BN-PAGE. Evite encher toda a câmara interna com tampão até as amostras serem carregadas.
- Se as amostras contiverem detergente, encher os poços com o tampão contendo 0,02% de Azul de Coomassie.
NOTA: Execute os passos 2.7-2.9 a 4 ° C.
- Se as amostras contiverem detergente, encher os poços com o tampão contendo 0,02% de Azul de Coomassie.
- Usando pontas de carga de gel, pipetar um volume de homogeneizado contendo 20 μg de proteína nos poços desejados. Pipetar um volume equivalente de 1x tampão de amostra BN-PAGE em poços não utilizados.
NOTA: Utilizar a concentração de proteína determinada a partir do ensaio de BCA para calcular o volume apropriado de homogeneizado a adicionar aos poços. - Depois as amostras são carregadas, encher a câmara interior com tampão 1x BN-PAGE em execução. Certifique-se o gel é inteiramente submerso em tampão. Em seguida, encher a câmara exterior com 1x tampão de corrida para o nível indicado pelo fabricante.
- Se as amostras contêm detergente, encher a câmara interior com o tampão 1x contendo 0,02% de azul de Coomassie, e a câmara exterior com tampão de corrida 1x isento de corante.
- Ligar os eléctrodos para a fonte de alimentação, e electroforese as proteínas no gel a 150 V até que a banda de corante progride ~ 2 centímetros em resolver camada. Parar e desligar a alimentação eléctrica.
3. A reticulação
NOTA: Efectuar os Passos 3,1-3,6 a 4 ° C.
- Desmontar o aparelho de electroforese, e separar as vidraças da cassete de gel. Remover e descartar a camada de empilhamento.
- Corte cuidadosamente o gel apenas abaixo da aresta inferior da frente do corante. Levaro cuidado de fazer este corte tão lisa e direita quanto possível, e, em seguida, descartar a peça não utilizada do gel. Isto deixará uma ~ 2 cm de largura, tira horizontal em gel de poliacrilamida, que contêm toda a proteína na amostra de homogenato.
- Aparar quaisquer porções não utilizadas ao longo das bordas da tira de gel.
- Cuidadosamente colocar a tira em 10 mL de tampão fosfato salino (PBS), em um recipiente pequeno, e misturar suavemente por nutação durante 30 minutos para equilibrar.
- Após equilíbrio, descartar e substituir o PBS com mais 10 ml. Pipetar 500 L de 25 mM de DSP dissolvido em sulfóxido de dimetilo na PBS, e continuar a misturar como anteriormente (passo 3.4), durante 30 min.
- Decantar a solução de DSP. Adicionar 10 ml de 0,375 M de tris (hidroximetil) aminometano (Tris-HCl), pH 8,8, contendo 2% de dodecilsulf ato de sódio (SDS) para extinguir o DSP que não reagiu. Continuar nutação durante 15 minutos.
4. SDS-PAGE
- Enquanto tira de gel é têmpera, preparar SDS-PASoluções de gel GE de acordo com métodos padrão 9. Não adicione reagentes de polimerização.
- Após terminar a reacção, voltar a tira de gel ΒΝ até à temperatura ambiente, e fundido a tira dentro de uma nova cassete de gel.
- Para fazer isso, cuidadosamente pegar o gel e colocá-lo sobre uma placa de gel de espaçador cassete limpo.
- Oriente a tira de modo que a parte inferior da frente do corante é mais próximo à parte superior da nova cassete (ou seja, o lado que viajou mais distante durante BN-PAGE deve ser o mais próximo do topo da nova cassete, a tira de gel deve ser invertida a partir do seu prévio orientação). Ver Figura 3.
- Colocar a tira de tal modo que o seu bordo superior encontra-se ainda com que a borda superior da placa de cobertura será (ou seja, ele vai estar no topo do gel de novo). Certifique-se a frente de corante é paralela às bordas horizontais da placa de vidro.
- Empurrar um lado da tira excisado contra uma das paredes do espaçador, deixando espaço no tele outro lado para o gel para ser vertida e um padrão de proteína, ou escada para ser carregado.
- Se a borda inferior da tira de gel contém quaisquer áreas serrilhadas ou irregulares, cortá-los cuidadosamente distância. Se estiver presente, eles vão bolhas armadilha durante gel de vazamento.
- Uma vez que a tira de gel está posicionada correctamente, colocar a placa de cobertura sobre a placa do espaçador. Aplique uma leve pressão para empurrar as bolhas de ar aprisionadas.
- Continuar a montar o aparelho que derrama-gel de acordo com as instruções do fabricante.
- Adicionar reagentes de polimerização para o tampão de gel de resolução, e despeje-a cassete de gel preparada, usando uma pipeta serológica. Encher a cassete de gel a aproximadamente 2 cm abaixo da tira de gel BN-PAGE excisado, para deixar espaço para a camada de empilhamento.
- Adicionar 100 mL de butanol sobre a parte superior do gel derramado, e permitir 30 min para a polimerização da camada de resolver. Decantar o butanol.
- Adicionar reagentes de polimerização para a solução de gel de empilhamento. Usando um serologpipeta ical, verter a camada de empilhamento para preencher todo o espaço vazio que permanece na cassete de gel.
- Inclinar a cassete de gel, como a camada de empilhamento é derramado de modo a preencher o espaço abaixo da tira de gel, e as bolhas de ar não estão presos.
- À medida que o tampão de gel de empilhamento preenche o espaço vazio por baixo da tira de gel, retornar gradualmente a cassete de gel a base de nível.
- Continuar a preencher o espaço vazio ao lado da tira de gel excisado com o tampão do gel de empilhamento, até que quase transborda.
- Permitir que a camada de empilhamento para polimerizar durante 30 minutos.
NOTA: Adicione 10x SDS-PAGE O tampão de corrida (Tris 250 mM (hidroximetil) aminometano (tris), 1.9 M de glicina, 1% de SDS), enquanto que o gel é a polimerização. Isso também pode ser feito com antecedência e armazenado à temperatura ambiente. - Dilui-se 50 mL de 10X de SDS-PAGE estoque tampão de corrida em 450 mL de dH2O para fazer tampão de trabalho 1x.
- Depois da camada de empilhamento tem polimerizado, remover a cassete de gel da vertendoaparelho, lavar com dH 2 O, e montar o aparelho de electroforese de acordo com as instruções do fabricante.
- Encher a câmara interior completamente com tampão de corrida SDS-PAGE 1x, em seguida, encher a câmara exterior para o nível indicado pelo fabricante.
- Carregar o espaço ao lado da tira de gel excisada com uma escada de peso molecular ou padrão de proteína apropriada.
- Anexar os eléctrodos para a fonte de alimentação, e electroforese das amostras a 120 V. Quando o corante de Coomassie corre fora do gel, parar e desligar a fonte de alimentação.
- Analisar o gel, utilizando métodos padrão de eiectromancheamento e detecção da proteína através da ligação 10 anticorpo.
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Representative Results
Neste experimento de demonstração, multero-PAGE foi realizada em toda lisado cérebro de rato. As proteínas resultantes separadas foram transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF), e em seguida sondadas com anticorpos contra proteínas que são conhecidas por formar complexos. A Figura 1 mostra uma validação do protocolo por dois meios. Em primeiro lugar, demonstra-se que as proteínas de ligação cruzada são susceptíveis ao corte por adição de um agente redutor, ou seja, as espécies de pesos moleculares mais elevados observados são formados pelo reagente de ligação cruzada, e não são devidas a qualquer outro componente do protocolo (Figura 1A) . Em segundo lugar, demonstra-se que a reticulação é sensível à adição de detergentes (Figura 1B), o que significa que a ligação cruzada é específico para proteínas complexadas e que a reactividade aleatória devido à proximidade no gel é minimizado. A Figura 2 demonstra que o método não consegue captar respcomplexo iratory II, mas por outro lado tem uma ampla aplicabilidade para capturar ambos os complexos solúveis e ligadas à membrana.
Figura 1: Validação do método multímero-PAGE. (A) Captura de complexos de proteínas por em gel de ligação cruzada com o DSP é sensível à clivagem pela dithiothretol (DTT). Multímero-PAGE foi realizada em todo o lisado de cérebro de rato sem (A1) ou com (A2) 5 mM dithiothretol incluído na solução de têmpera Tris / SDS. O gel foi electrotransf erido para membranas de PVDF, e depois testadas para cinesina cadeia pesada. Uma banda de elevado peso molecular é observado em ambas as membranas, provavelmente correspondendo a toda ou parte do complexo de protea motora cinesina. Há uma banda adicional que ocorre na 126 kDa no blot-tratada DTT, a massa molecular do ptido da cadeia pesada da cinesina. Ditiotreitol é um agente de redução, e é capaz de reverter cross-linking por clivagem da ligação dissulfureto presente no DSP. O agregado cinesina é portanto sensível à clivagem pela DTT. (B) proteína captura complexo é sensível à adição de detergentes desnaturantes. Multímero-PAGE foi realizada em todo o lisado de cérebro de rato, como descrito no texto, excepto quantidades crescentes (0 a 2%) de SDS (esquerda) ou de Triton X-100 (para a direita) foram adicionados às amostras de lisado, e, em seguida, incubadas em gelo durante 30 min antes de carregar o primeiro gel. Os géis finais foram transferidas para membranas de PVDF e sondado para α-sinucleína. Pelo menos três faixas de aumento do peso molecular são observados, o que corresponde a a-sinucleína monómero, tetrâmero e octâmero, respectivamente. As intensidades do sinal das bandas oligoméricos diminuir com o aumento da concentração de detergente, o que indica que de reticulação eficácia é dependente da conformação da proteína nativa. Por favor clique aqui para view uma versão maior desta figura.
Figura 2: Demonstração da captura de complexos de proteínas utilizando multímero-PAGE. Complexos proteicos solúveis e ligadas à membrana (A) foram capturadas a partir de (A) conjunto de rato lisado ou lisado cérebro (B) incubadas com 2% de digitonina durante 1 h a 4 ° C, através da realização de multímero-PAGE como descrito no texto. Os géis foram então transferidas e as membranas de PVDF sondadas para os componentes de vários complexos. espécies de elevado peso molecular são observadas na membrana sondada para tubulina acetilada, o que é conhecido para estabilizar os microtúbulos. Dineína e cinesina são complexos de proteínas de motor de múltiplas subunidades com pesos moleculares de 1,5 MDa e 380 kDa, respectivamente. As membranas blotted para componentes destes complexos mostre espécies de alto peso molecular. Além disso, multero-PAGE com sucesso captured o dímero HSP90. a-sinucleína forma tetreros e octâmeros, bem como neurotóxicos oligómeros de elevado peso molecular. O octero e uma sequência de espécies de peso mais elevado são vistos na membrana manchada. VDAC dimerização é também observada. espécies de elevado peso molecular são detectados nas membranas blotted para componentes de complexos mitocondriais I e IV. No entanto, a membrana riscados para SdhA, um membro do complexo II, não demonstra qualquer banda de alto peso molecular apropriado. AcetTUB: acetilado α-tubulina; βTUB: β-tubulina; Dineína: cadeia pesada dineína; proteína de choque térmico 90;: HSP90 Cinesina: cinesina cadeia pesada; NDUFS3: Centro de ferro-enxofre 3 do complexo mitocondrial I; VDAC: porina; SdhA: succinato desidrogenase do complexo mitocondrial II; COXIV: citocromo C oxidase mitocondrial de complexo IV. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Geral multímero-PAGE fluxograma. (A) Preparar lisado de tecidos, utilizando métodos não-desnaturantes, tais como a homogeneização em tampão de amostra de BN-PAGE. (B) lisado de pipeta em gel de BN-PAGE, em seguida, realizar a electroforese (150 volts) em tampão de corrida BN-PAGE. Permitir que a amostra migra até a frente do corante migrou ~ 2 cm para dentro do gel resolvente. (C) remover a camada de empilhamento e parte não utilizada da camada de resolver. (D) submergir a tira de gel em PBS, e equilibrar-se com agitação durante 30 min. (E) Remover o PBS e re-submergir a tira de gel em PBS contendo 2,5 mM de DSP. Agitar durante 30 min. (F) Remoção da solução de DSP, em seguida, re-submergir a tira de gel em Tris 375 mM contendo 2% de SDS, e agitar durante 30 min. Complexos presentes na tira de gel são agora estabilizada por cross-linking. (L) Rodar o gel de tira 180 ° e lança-se um novo gel de SDS-PAGE. Incluir tanto o empilhamento e a resolução de camadas. (H) Resolver amostra por electroforese (120 volts). (I) Retirar tira de gel e uma camada de empilhamento, em seguida, analisar a resolução de camada conforme necessário. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
interações proteína-proteína são importantes para cada tarefa seres vivos realizar. Devido a isso, eles são objecto de intenso escrutínio e pesquisa. Multímero-PAGE é um novo método para a captura, separar, e a análise de uma grande variedade de complexos de proteínas. Foi anteriormente demonstrado a sua aplicabilidade ao estudo oligimerization da doença associada à proteína α-sinucleína 11. No entanto, é extensível para muitos complexos de proteína, tal como demonstrado na Figura 2. Quando comparado com outros métodos de estudo complexos proteicos, multero-PAGE é vantajosa devido à sua simplicidade e brevidade. O tempo de amostra de tecido para totalmente separados em gel de SDS a cerca de 8 h. Uma vez que a detecção pode ser feito por transferência de western típico, o protocolo pode ser realizada em lisado de tecido não modificado, com limites de detecção muito mais baixos do que aqueles associados com experiências pull-down. Além disso, mais bem equipado labo biologia molecularratories será capaz de executar a técnica com pouco investimento inicial. Como é discutido mais tarde, a maior parte do desafio associado com multímero-PAGE vem com solução de problemas e optimizar o processo para cada complexo proteína estudada.
Enquanto multero-PAGE deve ser acessível para a maioria dos biólogos moleculares, o seu sucesso depende da habilidade e experiência do pesquisador. Criticamente, o corte e re-vazamento da tira de gel BN para o novo gel de SDS deve ser feito com cuidado. É importante que a orientação da faixa de gel de electroforese de modo a que faz com que as proteínas de migrar para o gel de SDS em bandas paralelas. Se a tira de gel é fundido torto, as bandas de proteína irá migrar para um outro e os dados serão perdidos. Especialmente para grandes complexos, girando a tira de gel antes de convertê-lo no gel de SDS-PAGE é igualmente importante. Isto dá complexos maiores, que podem não migraram muito longe dentro do gel BN-PAGE, de mais tempo para ser puxado para dentro da Laye resolverr do gel de SDS-PAGE. Importante, as alterações para o tamanho da proteína e características físicas causadas por ligação cruzada deve também ser considerado durante a análise. Por exemplo, algumas proteínas de baixo peso molecular, tais como α-sinucleína, não são bem retidos em membranas de PVDF, mas os seus oligómeros reticulados são 12. Isso pode confundir análise comparativa, e deve ser levado em conta.
Quando a separação de um complexo por multimero-PAGE, pela primeira vez, é importante para a validação do método. Sugerimos três testes de validação / solução de problemas. Em primeiro lugar, garantir que o péptido de interesse migra no gel BN, seguindo o protocolo de multímero-PAGE até excisão da tira de gel, em seguida, parar, secar a tira para uma membrana de PVDF, e sonda para a subunidade de interesse. Se não houver nenhum sinal, o complexo provavelmente não migrar para o gel BN, o que significa que deve ser feito mais porosa, ou a amostra deve ser permitido migrar mais para dentro do resolvcamada ing. Presença de um sinal que confirma subunidade, pelo menos, não ligado migraram no gel. Nesta fase, será difícil para confirmar a presença do complexo completo. Se a evidência da subunidade é detectado na tira de gel BN, passar para o segundo teste. Multímero realizar-PAGE, sem um passo de reticulação, então apagar para uma membrana de PVDF e sonda para a subunidade. A subunidade deve desnaturar na presença de SDS e migrar normalmente no gel de SDS. Se isso não ocorrer, é provável que exista algum problema com a técnica do pesquisador. A tira de gel BN pode ter sido mal cortado, deixando alguma proteína atrás, ou o gel de SDS podem ter sido expressos de forma incorrecta. Finalmente, executar multímero-PAGE com um passo de clivagem reticulante incluída, então blot e da sonda, como discutido na Figura 1. Isto confirma a agregação do complexo é devido à adição de DSP, e não uma consequência inesperada de alguma outra parte do protocolo multímero-PAGE. A clivagem deve resultar em uma reduçãod-intensidade da banda agregada e uma banda subunidade monómero aumento de intensidade de imagem em cima. Se nenhuma banda agregada é visto a partir de multímero-PAGE normal, mas o monómero aumenta em intensidade da banda quando DSP é clivada, o complexo tem provavelmente feito para o gel de SDS, mas não para migrar para a camada de resolver.
No seu estado presente, multero-PAGE é aplicável a muitos complexos de proteína, mas não é de um tamanho único para todos protocolo. Ele provavelmente precisa ser modificado para cada complexo de interesse. Um problema comum é demonstrado na Figura 2: complexos capturados são frequentemente tão grandes que mal migrar em SDS-PAGE. Isto pode ser controlado alterando a porosidade do gel de SDS ou realizando electroforese por longos períodos de tempo. Uma complicação adicional é a presença ocasional de mais do que duas bandas no gel. Reacção incompleta com o agente de reticulação pode resultar numa distribuição de intermediários bandas de peso molecular 13. Isto pode tornar mais difcil para determinar se múltiplas bandas são representativos dos intermediários oligoméricos fisiologicamente importantes, ou simplesmente consequências não desejadas de reticulação parcial. Para as proteínas de membrana que devem ser solubilizadas antes da análise, é também importante considerar o impacto que a escolha de detergente tem sobre o comportamento dos complexos de proteínas. O detergente utilizado para solubilizar proteínas de membrana afecta as suas conformações, associações com parceiros de ligao, e funciona 14, 15. Escolha detergente também tem impacto na eficácia da ligação cruzada 16. Assim, é provável que as condições ideais de solubilização variará com o complexo a ser estudado.
Multímero-PAGE, ocasionalmente, falha para capturar um complexo, como é mostrado na blot SdhA na Figura 2. Succinato desidrogenase é parte do complexo mitocondrial 124 kDa II, que é suficientemente pequena para que ele deve mover-se facilmente no gel.Que não foi detectado indica que multimer-PAGE não conseguiu capturá-lo. Casos como estes têm muitas explicações possíveis. A maior parte dos reagentes de reticulação contém duas extremidades reactivas, que formam ligações covalentes com cadeias laterais de aminoácidos. A eficiência com a qual os reagentes de reticulação captam complexos de proteína depende da sua acessibilidade aos resíduos reactivos. No caso da DSP, a reticulação é realizada por acilação de grupos amino alifáticos primários e secundários expostos a solventes, usualmente os grupos ε-amino da lisina 17 . Os resíduos de lisina são normalmente encontrados na superfície da proteína, mas o seu sequestro ocasional em centros hidrofóbicos diminui a eficiência da reticulação 13 . As subunidades do complexo II estão enterradas na membrana mitocondrial e podem permanecer inacessíveis à DSP, mesmo após a solubilização com a digitonina 18 . Os complexos muito grandes e densamente-empacotando, tais como o oligome amyloidrs, também podem limitar a disponibilidade de resíduos de lisina de superfície de reagentes de reticulação. Como resultado, estes tipos de montagens de proteína podem não ser compatíveis com multímero-PAGE. É também possível que com azul de Coomassie, que se liga às regiões hidrofóbicas e resíduos catiónicos, persiste após equilíbrio em PBS e blocos de ligação cruzada, em alguns casos 19. Isso pode diminuir ou eliminar a detecção de oligómeros afectadas por multimero-PAGE. Assim, o método não é um ensaio universal para a caracterização de todas as associações de proteínas, e não deve ser considerada onde quantificação em desejado. No entanto, multero-PAGE é uma ferramenta barata, relativamente rápido para a análise de complexos de proteína, e podem ser considerados juntamente com outras vias estabelecidas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Compatível com o DA034783 NIH / NIDA. Agradecemos Bryan A. Killinger de assistência técnica com o multimero-PAGE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| ε-Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic. |
| Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) | BioRad | 161-0148 | Toxic. |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti rabbit IgG-HRP from goat | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Bicinchoninic acid assay kit | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Chemiluminescence substrate kit | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D128-1 | |
| Dithiobis(succinimidylpropionate) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Dry nonfat milk | LabScientific | M0841 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermofisher | 78430 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144SI-212 | For titration. Caustic. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | For PVDF membrane activation. Toxic. |
| Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| N,N'-methylenebisacrylamide | Acros Organics | 16479 | Toxic. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Polyvinylidene fluoride transfer membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 88265 | |
| SDS solution (10% w/v) | BioRad | 161-0416 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L37771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) | BioRad | 161-0798 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| ImageJ software | NIH | ||
| Synergy H1 microplate reader | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 2 mL dounce homogenizer | |||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Ultrasonic tissue homogenizer | Fisher Scientific | FB120220 |
References
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