Hippocampe organotypiques comme modèle d’étude Neuroprotection et son caractère invasif des cellules tumorales

Summary

Hippocampe organotypiques (CSST) représentent un modèle in vitro qui simule la situation in vivo très bien. Nous décrivons ici une base vibratome amélioré tranchage protocole pour obtenir des tranches de haute qualité devant servir à évaluer le potentiel neuroprotecteur de substances nouvelles ou le comportement biologique des cellules tumorales.

Abstract

Dans l’hippocampe organotypiques (CSST), les caractéristiques morphologiques et fonctionnelles des neurones et de cellules gliales sont bien conservés. Ce modèle est adapté pour répondre aux questions de recherche différentes qui impliquent des études sur la neuroprotection, expériences électrophysiologiques sur les neurones, les réseaux neuronaux ou invasion tumorale. L’architecture de l’hippocampe et l’activité neuronale dans les circuits de multisynaptic sont bien conservées dans CSST, même si la procédure de trancher elle-même initialement des lésions et conduit à la formation d’une cicatrice gliale. La formation de cicatrices modifie sans doute les propriétés mécaniques et le comportement de diffusion de petites molécules, etc.. Tranches de permettent le suivi des processus dépendants du temps après traumatisme crânien sans chirurgie animale et les études sur les interactions entre les divers types de cellules encéphales, nommément astrocytes, la microglie et les neurones sous tant physiologiques que pathologiques conditions. Un aspect ambivalent de ce modèle est l’absence de flux sanguin et immunitaire des cellules sanguines. Au cours de la progression de la lésion neuronale, la migration des cellules immunitaires d’après la pièce de sang un rôle important. Comme ces cellules manquent en tranches, on peuvent observer les processus intrinsèques dans la culture sans ingérence extérieure. En outre, à la CSST la composition de l’environnement du milieu extérieur est contrôlée avec précision. Un autre avantage de cette méthode est la diminution du nombre d’animaux sacrifiés par rapport aux préparations standards. Plusieurs CSST peut provenir d’un animal permettant des études simultanées avec des traitements multiples chez un animal. Pour ces raisons, la CSST sont bien adaptés pour analyser les effets de nouvelles thérapeutiques de protection après des lésions tissulaires ou au cours de l’invasion tumorale.

Le protocole présenté ici décrit une méthode de préparation de la CSST qui permet de générer très reproductible, bien conservé les tranches qui peuvent être utilisés pour une variété de recherches expérimentales, comme études invasion neuroprotection ou une tumeur.

Introduction

CSST sont un modèle bien caractérisés in vitro pour étudier les propriétés physiologiques et pathologiques des neurones, les astrocytes et les cellules microgliales¹. Il est facile de contrôler l’environnement extracellulaire et de surveiller les changements morphologiques et cellulaires après divers stimuli. L’Organisation des neurones de l’hippocampe et leurs connexions sont bien conservées après préparation^2,3. De plusieurs avantages, CSST permettent la surveillance de l’invasion de lésions et tumeurs cérébrales sans chirurgie animale. Six à huit CSST peut être obtenues d’un seul cerveau de rongeur. CSST contribue ainsi à considérablement réduire le nombre d’animaux et permettent de tester plusieurs concentrations du médicament, des manipulations génétiques ou modèles de lésion différents chez le même animal. Dans les essais axés sur la tranche, conditions expérimentales peuvent être contrôlées avec précision. En outre, temps de développement dépendant d’états pathologiques comme dommages secondaires peuvent facilement être surveillés par imagerie de Time-lapse.

Dans le protocole donné, initialement créé par Stoppini et al. ⁴, les étapes de préparation sont décrites et morphologiques marquants pour la sélection des tranches appropriées sont mises en évidence. Nous vous recommandons la préparation des jours après la naissance, 7-9 rats ou des souris postnatal jour 4-5. Dans ces périodes, la CSST montrent une solide résistance aux traumatismes mécaniques et un potentiel élevé pour la réorganisation des circuits neuronaux. En revanche, préparations des rats adultes ou embryonnaires rapidement modifient leur structure et perdent leur morphologie organotypique pendant la culture et sont donc moins adaptées pour l’étude des processus à long terme dans la recherche fondamentale^{5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11}. un autre point critique pour la survie de la CSST est l’épaisseur de la tranche lui-même comme la diffusion et donc l’apport en nutriments sont limitées^12,13,14.

Protocol

des expérimentations animales ont été effectuées conformément à la politique d’éthique et de la politique sur l’utilisation des animaux dans la recherche en neurosciences, tel qu’approuvé par l’européen collectivités Conseil Directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil de l’Union européenne sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. 1. préparation des Instruments et des milieux de Culture pour la préparation de la CSST, ut…

Representative Results

Études de Neuroprotection : Pour déterminer les dommages neuronaux, le nombre de noyaux positifs PI et IB4 positif la microglie dans chaque troisième section optique de la couche de cellules de granules (GCL) du gyrus denté (DG) a été comptée. Pour des expériences d’invasion tumorale, la z-projection d’intensité maximale de la pile a été utilisée pour calculer la superficie couverte par les cellules tumorales, en guise d’invasion et de visual…

Discussion

Le présent protocole décrit la préparation de la CSST. Ce modèle permet de tester les capacités intrinsèques et les réactions du tissu cérébral après l’application de stimuli physiologiques et pathologiques. En plus des analyses des paramètres électrophysiologiques, CSST peut être lésé, et les effets de dégâts sur tous les types de cellules peuvent être déterminés. Traitement avec différentes matières, la description détaillée des procédés de lésion ou de guérison en l’absence des macropha…

Materials

6-Well	Falcon	35-3046
Agar	Fluka	5040
Autoclav	Systec	DX-45
CFDA	Thermo Fisher	V12883
Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700	Carl Zeiss
Eagle´s Minimal Essential Medium	Invitrogen	32360-034
Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I	Vector Labs	FL-1101
Fluorescein labeled GSL I – isolectin B4	Vector Labs	FL-1201
Glucose	Merk	1083371000
Glutamin	Invitrogen	25030-024
Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+)	Invitrogen	24020-133
Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+  and Mg2+)	Invitrogen	14170-138
Insulin	Sigma Aldrich	I5500
L-ascorbic acid	Sigma Aldrich	A5960
L-Glutamin	Invitrogen	25030-024
LN229	Cell-Lines-Service	300363
Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue)	B.Braun	1050052
Millicell Culture Inserts	Millipore	PICMORG50
NMDA N-methyl-D-aspartic acid	Sigma Aldrich	M3262
Normal Horse Seum	Invitrogen	26050-088
Penicillin Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Petri dishes (all sizes)	Greiner	627160/664160/628160
PFA	Roth	0335.1	toxic
Propidium iodid (PI)	Sigma Aldrich	81845-25MG	toxic
U138	ATCC	HTB-14
Vibratome	Leica	Leica VT 1200