Organotypic гиппокампа ломтик культур как модель для изучения нейропротекции и инвазии опухолевых клеток
Summary
Organotypic гиппокампа ломтик культур (страховой) представляют собой модель в пробирке , которая моделирует ситуацию в естественных условиях очень хорошо. Здесь мы описываем, основанных на vibratome улучшение нарезки протокол для получения фрагментов высокого качества для использования в оценке нейропротекторной потенциал новых веществ или биологическое поведение опухолевых клеток.
Abstract
В культурах гиппокампа срез organotypic (ОАО) хорошо сохранились Морфологические и функциональные характеристики нейронов и глиальных клеток. Эта модель подходит для решения различных исследовательских вопросов, которые включают исследования по нейропротекции, электрофизиологические эксперименты на нейроны, нейронных сетей или прорастание опухоли. Гиппокампа архитектуры и активности нейронов в multisynaptic цепи хорошо сохраняется в страховой, хотя сама процедура нарезки первоначально поражений и приводит к формированию глиальный рубец. Формирование рубца изменяет предположительно механических свойств и диффузионного поведение малых молекул и др. Фрагменты позволяют контролировать время зависимых процессов после травм головного мозга без животных хирургия и исследования по вопросам взаимодействия между различными типами клеток мозга, полученных, а именно астроциты, Микроглия и нейронов под физиологических и патологических условий. Двойственные аспектом этой модели является отсутствие кровотока и иммунных клеток крови. При прогрессировании нейронных травмы перенос иммунные клетки из крови играют важную роль. Поскольку эти клетки отсутствуют в фрагменты, внутренние процессы в культуре может наблюдаться без внешнего вмешательства. Кроме того в страховой точно контролируется состав средне внешней среды. Еще одним преимуществом данного метода является меньшее количество жертвенных животных, по сравнению с стандартным препаратов. Несколько OHSC можно получить из одного животного, возможность одновременного исследования с несколько процедур в одном животном. По этим причинам страховой хорошо подходят для анализа воздействия новых защитных терапии после повреждения тканей или во время вторжения опухоли.
Протокол представил здесь описывается метод подготовки страховой, которая позволяет генерировать высокую воспроизводимость, хорошо сохранились фрагменты, которые могут быть использованы для целого ряда экспериментальных исследований, как нейропротекторного эффекта или опухоль вторжения исследования.
Introduction
Страховой являются хорошо изученных в vitro модель для изучения физиологических и патологических свойства нейронов, астроциты и микроглии1. Это легко управлять средой внеклеточные и мониторинга сотовых и морфологические изменения после различные стимулы. Организация гиппокампа нейронов и их соединения хорошо сохранились после подготовки2,3. Из несколько преимуществ страховой позволяют контролировать вторжения травмы и опухоли головного мозга без животных хирургия. Шесть-восемь страховой можно получить от одного грызунов мозга. Страховой поэтому помочь существенно уменьшить количество животных и позволяют тестирования нескольких концентрации наркотиков, генетические манипуляции или различные поражения модели в то же самое животное. В основе ломтик анализов экспериментальных условиях может управляться точно. Кроме того время зависит от развития патологических состояний как вторичные убытки может легко контролироваться покадровой изображений.
В заданном протоколе, первоначально учрежденной Stoppini et al. 4подготовка шаги описываются и выделены морфологическая достопримечательности для отбора соответствующих фрагментов. Мы рекомендуем подготовку послеродовой 7-9 день крыс или мышей послеродовой день 4-5. В эти периоды страховой Показать надежный сопротивление механических травм и высокий потенциал для реорганизации нейронных цепей. В отличие от этого препараты от эмбриональных или взрослых крыс быстро изменить их структуру и теряют их морфология organotypic во время выращивания и поэтому меньше подходят для изучения долгосрочных процессов в фундаментальных исследований5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. Другой критической точкой для выживаемости страховой является толщина среза, сам, как диффузии и, таким образом, питательных являются ограниченные12,,1314.
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящий Протокол описывает подготовку страховой. Эта модель позволяет тестирование встроенных возможностей и реакции ткани головного мозга после применения физиологических и патологических стимулов. Помимо анализа электрофизиологические параметры страховой может быть пораженн?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Christine Auste за ее поддержку с видео-записи и Гадбан Chalid за его прекрасную техническую помощь. Urszula Grabiec было поддержано FKZ программа ру 29/18.
Materials
| 6-Well | Falcon | 35-3046 | |
| Agar | Fluka | 5040 | |
| Autoclav | Systec | DX-45 | |
| CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
| Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
| Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
| Fluorescein labeled GSL I – isolectin B4 | Vector Labs | FL-1201 | |
| Glucose | Merk | 1083371000 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
| Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
| Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
| PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
| Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
| U138 | ATCC | HTB-14 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |
References
- Gähwiler, B. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20 (10), 471-477 (1997).
- Bahr, B. A. Long-Term Hippocampal Slices: A Model System for Investigating Synaptic Mechanisms and Pathologic Processes. J Neurosci Res. 42 (3), 294-305 (1995).
- Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protoc. 2013 (12), 1142-1148 (2013).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Kleinberger-Doron, N., Schramm, M. Culture of mature hippocampus slices for 4 days in a newly developed medium: preservation of transmitter release and leucine incorporation into protein. Brain Res. 533 (2), 239-247 (1990).
- Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Res Bull. 84 (1), 39-44 (2011).
- Gähwiler, B. H. Organotypic Monolayer Cultures of Nervous Tissue. J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).
- Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends Neurosci. 11 (11), 484-489 (1988).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocamal slice culture from the adult mouse brain: A versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Xiang, Z., Hrabetova, S., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J Neurosci Methods. 98, 145-154 (2000).
- Adamchik, Y., Frantseva, M. V., Weisspapir, M., Carlen, P. L., Perez Velazquez, J. L. Methods to induce primary and secondary traumatic damage in organotypic hippocampal slice cultures. Brain rRes Brain Res Protoc. 5, 153-158 (2000).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Curr Neuropharmacol. 5 (1), 19-33 (2007).
- Noraberg, J., Poulsen, F. R., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 4 (4), 435-452 (2005).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. a Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550 (Pt 1), 135-147 (2003).
- Poindrom, P., Piguet, P., Förster, E. . New Methods for Culturing Cells from Nervous Tissues. , (2005).
- Berger, T., Frotscher, M. Distribution and morphological characteristics of oligodendrocytes in the rat hippocampus in situ and in vitro: An immunocytochemical study with the monoclonal Rip antibody. J Neurocytol. 23 (1), 61-74 (1994).
- Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
- Bonde, C., Sarup, A., Schousboe, A., Gegelashvili, G., Zimmer, J., Noraberg, J. Neurotoxic and neuroprotective effects of the glutamate transporter inhibitor DL-threo-beta-benzyloxyaspartate (DL-TBOA) during physiological and ischemia-like conditions. Neurochem Int. 43 (4-5), 371-380 (2003).
- Derouiche, A., Heimrich, B., Frotscher, M. Loss of layer-specific astrocytic glutamine synthetase immunoreactivity in slice cultures of hippocampus. Eur J Neurosci. 5 (2), 122-127 (1993).
- Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18 (4), 319-331 (1996).
- Hailer, N. P., Wirjatijasa, F., Roser, N., Hischebeth, G. T. R., Korf, H. W., Dehghani, F. Astrocytic factors protect neuronal integrity and reduce microglial activation in an in vitro model of N-methyl-D-aspartate-induced excitotoxic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 315-326 (2001).
- Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
- Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: A model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochem Res. 30 (12), 1521-1528 (2005).
- Guy, Y., Rupert, A. E., Sandberg, M., Weber, S. G. A simple method for measuring organotypic tissue slice culture thickness. J Neurosci Methods. 199 (1), 78-81 (2011).
- Grabiec, U., Koch, M., et al. The endocannabinoid N-arachidonoyldopamine (NADA) exerts neuroprotective effects after excitotoxic neuronal damage via cannabinoid receptor 1 (CB 1). Neuropharmacology. 64 (4), 1797-1807 (2012).
- Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Exp Neurol. 248, 429-440 (2013).
- Ebrahimi, F., Hezel, M., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. Analyses of neuronal damage in excitotoxically lesioned organotypic hippocampal slice cultures. Ann Anat. 192 (4), 199-204 (2010).
- He, S., Shao, L. R., Wang, Y., Bausch, S. B. Synaptic and extrasynaptic plasticity in glutamatergic circuits involving dentate granule cells following chronic N-methyl-D-aspartate receptor inhibition. J Neurophysiol. 109 (6), 1535-1547 (2013).
- Kann, O., Taubenberger, N., et al. Muscarinic receptor activation determines the effects of store-operated Ca2+-entry on excitability and energy metabolism in pyramidal neurons. Cell Calcium. 51 (1), 40-50 (2012).
- Pérez-Gómez, A., Tasker, R. A. Enhanced neurogenesis in organotypic cultures of rat hippocampus after transient subfield-selective excitotoxic insult induced by domoic acid. Neuroscience. 208, 97-108 (2012).
- Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gähwiler, B. H. Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Mol Cell Neurosc. 26 (2), 241-250 (2004).
- Pozzo Miller, L. D., Mahanty, N. K., Connor, J. A., Landist, D. M. D. Pyramidal Cell Death in Slice Cultures From Rat Hippocampus Is Prevented By Glutamate Receptor Antagonists. Neuroscience. 63 (2), (1994).
- Koch, M., Kreutz, S., et al. The cannabinoid WIN 55,212-2-mediated protection of dentate gyrus granule cells is driven by CB 1 receptors and modulated by TRPA1 and Ca v2.2 channels. Hippocampus. 21 (5), 554-564 (2011).
- Pukrop, T., Dehghani, F., et al. Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way. Glia. 58 (12), 1477-1489 (2010).
- Kohl, A., Dehghani, F., Korf, H. W., Hailer, N. P. The bisphosphonate clodronate depletes microglial cells in excitotoxically injured organotypic hippocampal slice cultures. Exp Neurol. 181 (1), 1-11 (2003).
- Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model. Biochem Biophys Res Commun. 269 (2), 513-520 (2000).
- Aaberg-Jessen, C., Nørregaard, A., Christensen, K., Pedersen, C. B., Andersen, C., Kristensen, B. W. Invasion of primary glioma- and cell line-derived spheroids implanted into corticostriatal slice cultures. Int J Clin Exp Pathol. 6 (4), 546-560 (2013).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
- Hagemann, C., Fuchs, S., et al. Impact of MACC1 on human malignant glioma progression and patients ‘ unfavorable prognosis. Neuro Oncol. 15 (12), 1696-1709 (2013).
- Hohmann, T., Grabiec, U., Ghadban, C., Feese, K., Dehghani, F. The Influence of Biomechanical Properties and Cannabinoids on Tumor Invasion. Cell Adh Migr. 11 (1), 54-67 (2016).
