Organotypic हिप्पोकैम्पस एक मॉडल के रूप में Neuroprotection और ट्यूमर कोशिकाओं की इनवेसिव अध्ययन के लिए संस्कृतियों स्लाइस
Summary
Organotypic हिप्पोकैम्पस स्लाइस संस्कृतियों (OHSC) एक इन विट्रो मॉडल है कि vivo स्थिति में बहुत अच्छी तरह से simulates प्रतिनिधित्व करते हैं । यहाँ हम एक vibratome आधारित सुधार टुकड़ा करने की क्रिया प्रोटोकॉल उपन्यास पदार्थों या ट्यूमर कोशिकाओं के जैविक व्यवहार की न्यूरोप्रोटेक्टिव क्षमता का आकलन करने में उपयोग के लिए उच्च गुणवत्ता स्लाइस प्राप्त करने के लिए वर्णन.
Abstract
organotypic हिप्पोकैम्पस स्लाइस संस्कृतियों में (OHSC), दोनों ंयूरॉंस और glial कोशिकाओं के रूपात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं को अच्छी तरह से संरक्षित कर रहे हैं । इस मॉडल के विभिंन अनुसंधान प्रश्न है कि neuroprotection पर अध्ययन शामिल है, न्यूरॉन्स, न्यूरॉन्स नेटवर्क या ट्यूमर के आक्रमण पर electrophysiological प्रयोगों को संबोधित करने के लिए उपयुक्त है । हिप्पोकैम्पस वास्तुकला और multisynaptic सर्किट में न्यूरॉन गतिविधि अच्छी तरह से OHSC में संरक्षित कर रहे हैं, भले ही टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया शुरू में ही घावों और एक glial निशान के गठन की ओर जाता है. निशान गठन संभवतः यांत्रिक गुणों और छोटे अणुओं के प्रसार व्यवहार को बदल, आदि स्लाइस पशु शल्य चिकित्सा के बिना मस्तिष्क की चोट के बाद समय पर निर्भर प्रक्रियाओं की निगरानी की अनुमति, और विभिन्न मस्तिष्क के बीच बातचीत पर अध्ययन कोशिका प्रकार, अर्थात् astrocytes, microglia और ंयूरॉंस दोनों शारीरिक और रोग स्थितियों. इस मॉडल का एक ambivalent पहलू रक्त प्रवाह और प्रतिरक्षा रक्त कोशिकाओं के अभाव है । न्यूरॉन की चोट की प्रगति के दौरान, रक्त से प्रतिरक्षा कोशिकाओं को पलायन एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । के रूप में उन कोशिकाओं स्लाइस में लापता हैं, संस्कृति में आंतरिक प्रक्रियाओं बाहरी हस्तक्षेप के बिना मनाया जा सकता है । इसके अलावा, OHSC में मध्यम-बाह्य वातावरण की संरचना को ठीक नियंत्रित किया जाता है । इस विधि का एक और लाभ मानक तैयारियों की तुलना में बलि पशुओं की कम संख्या है । कई OHSC एक जानवर संभव एक जानवर में कई उपचार के साथ एक साथ अध्ययन करने से प्राप्त किया जा सकता है । इन कारणों के लिए, OHSC अच्छी तरह से ऊतक क्षति के बाद या ट्यूमर के आक्रमण के दौरान नए सुरक्षात्मक चिकित्सकीय के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए अनुकूल हैं ।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल OHSC कि अत्यधिक प्रतिलिपि, अच्छी तरह से संरक्षित स्लाइस कि प्रयोगात्मक अनुसंधान की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, neuroprotection या ट्यूमर के आक्रमण के अध्ययन की तरह पैदा की अनुमति देता है की एक तैयारी विधि का वर्णन करता है ।
Introduction
OHSC एक अच्छी तरह से विशेषता इन विट्रो मॉडल में न्यूरॉन्स, astrocytes और microglia1के दोनों शारीरिक और रोग गुणों का अध्ययन कर रहे हैं । यह extracellular पर्यावरण को नियंत्रित करने और विभिन्न उत्तेजनाओं के बाद सेलुलर और रूपात्मक परिवर्तन की निगरानी करने के लिए आसान है । हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के संगठन और उनके कनेक्शन अच्छी तरह से तैयार करने के बाद संरक्षित कर रहे हैं2,3. कई फायदे से, OHSC पशु शल्य चिकित्सा के बिना मस्तिष्क की चोट और ट्यूमर के आक्रमण की निगरानी की अनुमति देते हैं । छह से आठ OHSC एक भी कुतर ब्रेन से प्राप्त किया जा सकता है । OHSC इसलिए काफी पशुओं की संख्या को कम करने और एक ही जानवर में कई दवा सांद्रता, आनुवंशिक जोड़तोड़ या अलग घाव मॉडल के परीक्षण की अनुमति मदद करते हैं । स्लाइस में आधारित परख, प्रयोगात्मक स्थितियों ठीक नियंत्रित किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, द्वितीयक नुकसान की तरह रोग स्थितियों के समय निर्भर विकास आसानी से समय चूक इमेजिंग द्वारा निगरानी की जा सकती है ।
दिए गए प्रोटोकॉल में, मूल रूप से Stoppini एट अल द्वारा स्थापित । 4, तैयारी चरण बताए गए है और उपयुक्त स्लाइस के चयन के लिए महत्वपूर्ण रूपात्मक लैंडमार्क हाइलाइट किए गए हैं । हम प्रसव दिन 7-9 चूहों या प्रसव दिन 4-5 चूहों की तैयारी की सलाह देते हैं. इन समय में, OHSC यांत्रिक आघात के लिए एक मजबूत प्रतिरोध और न्यूरॉन सर्किट के पुनर्गठन के लिए एक उच्च क्षमता दिखा । इसके विपरीत, भ्रूण या वयस्क चूहों से तैयारी तेजी से अपनी संरचना को बदलने और खेती के दौरान अपने organotypic आकृति विज्ञान खो देते हैं और इसलिए बुनियादी अनुसंधान में लंबी अवधि प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए कम उपयुक्त हैं5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. OHSC के जीवित रहने की दर के लिए एक और महत्वपूर्ण बिंदु ही प्रसार और इस प्रकार पोषक तत्वों की आपूर्ति के रूप में टुकड़ा की मोटाई है सीमित कर रहे है12,13,14।
Protocol
पशु प्रयोगों के अनुसार नैतिकता की नीति और तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में पशुओं के उपयोग पर नीति के रूप में यूरोपीय समुदाय परिषद के डायरेक्टर 2010/63/यूरोपीय संघ के यूरोपियन संसद और के द्वारा अनुमोदित कि?…
Representative Results
Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल OHSC की तैयारी का वर्णन करता है । यह मॉडल आंतरिक क्षमताओं और मस्तिष्क ऊतक के शारीरिक और रोग उत्तेजनाओं के आवेदन के बाद प्रतिक्रियाओं के परीक्षण की अनुमति देता है । electrophysiological मापदंडों के व…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक अपनी उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए वीडियो रिकॉर्डिंग और चल्द Ghadban के साथ उसके समर्थन के लिए क्रिस्टीन Auste शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । Urszula Grabiec रॉक्स Programm FKZ 29/18 द्वारा समर्थित था ।
Materials
| 6-Well | Falcon | 35-3046 | |
| Agar | Fluka | 5040 | |
| Autoclav | Systec | DX-45 | |
| CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
| Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
| Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
| Fluorescein labeled GSL I – isolectin B4 | Vector Labs | FL-1201 | |
| Glucose | Merk | 1083371000 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
| Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
| Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
| PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
| Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
| U138 | ATCC | HTB-14 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |
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