Bepaling van de relatieve sterkte van een Anti-TNF monoklonaal antilichaam (mAb) door Neutralizing TNF met behulp van een In Vitro Bioanalytical methode
Summary
Een protocol voor de bepaling van de relatieve anti-apoptotic activiteit van een anti-TNFα mAb een neutralisatie-mechanisme met WEHI 164 cellen wordt hier gepresenteerd. Dit protocol is handig voor het vergelijken van de sterkte van de neutralisatie van verschillende moleculen met dezelfde biologische functionaliteit.
Abstract
Dit protocol geeft de meting van de apoptotic activiteit neutralisatie van TNFα in een fibroblast mobiele muismodel (WEHI 164) met behulp van een anti-TNFα mAb. Bovendien, kan dit protocol worden gebruikt om te evalueren van de andere anti-TNFα-moleculen, zoals fusie-eiwitten. De cellulaire model hier werkzaam is gevoelig voor TNFα-gemedieerde apoptosis wanneer een extra stress-factor wordt geïnduceerd in cel kweekomstandigheden (bijvoorbeeld serum ontbering). Deze procedure is een voorbeeld van hoe uit te voeren van deze analytische assay, markeren de belangrijkste verrichtingen in verband met de bereiding van de monsters, cel verdunning apoptose inductie en spectrofotometrische metingen die essentieel zijn voor het waarborgen van de succesvolle resultaten. Dit protocol blijkt de best presterende voorwaarden met betrekking tot apoptose inductie en efficiënte signaal opnemen, leidt tot lage onzekerheid waarden.
Introduction
Biologische potentie is de kwantitatieve meting van biologische activiteit, gebaseerd op de getest productkenmerken die zijn gekoppeld aan de relevante biologische eigenschappen, terwijl de hoeveelheid (uitgedrukt in de massa) is een fysisch-chemische maatregel van het eiwitgehalte. Potentie vermoeidheidstests zorgen samen met andere analytische methodologieën, worden uitgevoerd als onderdeel van de conformiteit van het product, stabiliteit en vergelijkbaarheid studies. In deze zin, worden potentie metingen gebruikt om aan te tonen dat product partijen voldoen aan de kritische kwaliteitsattributen (CQAs) of aanvaardingscriteria tijdens alle fasen van de klinische proeven en na goedkeuring van de markt.
Apoptosis is geprogrammeerde celdood, natuurlijk voorkomende wanneer cellen zijn besmet met een virus, of wanneer de cellen worden benadrukt door een milieu factor dat compromissen cellulaire levensvatbaarheid en functie1,2. O.a. behoort apoptosis remming, of biologische neutralisatie, tot de hoofdzakelijk bekende therapeutische mechanismen van mAbs, met name bij de behandeling van chronische ziekten, zoals immuun-gemedieerde inflammatoire aandoeningen. Anti-TNFα moleculen oefenen hun therapeutische eigenschappen door het blokkeren van de interactie van Tumornecrosefactor alfa (TNFα) met de p55 en p75 cel oppervlakte receptoren3, waardoor signaal trajecten die uiteindelijk zal tot cellulaire apoptosis leiden.
TNFα kunnen produceren ontsteking in sommige chronische ziekten4. TNFα is het onecht uitgescheiden in de extracellulaire milieu door macrofagen, die schildwachten van het aangeboren immuunsysteem en de voornaamste actoren in dit soort ziekte5. Als een gemeenschappelijke weg wordt TNFα deregulering geassocieerd met de pathogenese van deze ziekten. Zonder controle en onder constante inductie en cel stress induceert TNFα cel dood en weefsel degeneratie, uiteindelijk leidde tot reumatoïde artritis, ziekte van Crohn en andere pathologische profielen6.
TNF-antagonisten die blokkeren van de interactie tussen TNF en haar receptoren zijn steeds gebruikt als een effectieve therapie te verminderen symptomatology en belemmeren de voortgang van deze ziekten. Tegenwoordig, worden anti-TNFα geneesmiddelen veel gebruikt om te controleren de systemische concentratie van deze cytokine, waardoor verdere ontaarding van betrokken weefsels. In dit opzicht is het noodzakelijk die bieden een reproduceerbaar en robuuste bioassay om te beschrijven het specifiek vermogen van een drug om haar biologische effect te bereiken.
In dit protocol, kritische stappen-vastgesteld tijdens de ontwikkeling van een neutralisatie assay-voor het succesvol meten van de biologische werkzaamheid worden gemarkeerd, met een bijzondere nadruk op de vaardigheden die nodig zijn voor het uitvoeren van de bio-analysemethode. Deze bio-analytische methode informatie nuttig vergelijkbaarheid tussen de verschillende batches instellen of anti-TNFα geneesmiddelen in vergelijking met een klinisch geteste referentiestof.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze karakterisering helpt te bepalen een priori het biologisch gedrag van een molecuul onder ontwikkeling voordat dure en tijdrovende klinische proeven zijn uitgevoerd. Het is ook nuttig voor de-charges-release van het product van een goedgekeurde drug. Het is vermeldenswaard dat deze testen nuttig zijn om te bepalen of een molecule een voldoende biologisch effect met betrekking tot het werkingsmechanisme heeft. De bio-analytische methode gepresenteerd in deze tutorial is uitermate belangrijk om de vergelijking…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de nationale Raad voor wetenschap en technologie (CONACYT), Mexico verlenen PEI CONACYT 2015 220333, zonder deelname van het ontwerp van de studie.
Materials
| WEHI 164 | ATCC | CRL-1751 | Fibrosarcoma cells from Mus musculus |
| RPMI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| RPMI 1640 Medium, no phenol red | GIBCO | 11835-030 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| Trypsin-EDTA(0.25%),phenol red | GIBCO | 25200-056 | Store medium at -10 °C to -20 °C |
| DPBS, no calcium, no magnesium | GIBCO | 14190-136 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| Recombinant Human TNF-alpha Protein | R&D Systems | 210-TA-020 | Store at -20 °C to -70 °C |
| Fetal Bovine Serum (U.S), Super Low IgG | HyClone | SH3089803 | Store at -10 °C to -20 °C |
| Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized | HyClone | SH3007103 | Store at -10 °C to -20 °C |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8093 | Store the Caspase-Glo. 3/7 Substrate and Caspase-Glo. 3/7 Buffer at –20 ºC protected fromLight |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. Reagent | J.T.Baker | 8993-01 | — |
| Sample mAb Adalimumab | Probiomed | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
| Reference and Control mAb Adalimumab | Abbvie | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 | SpectraMax M3 Multi-Mode |
| Microplate reader Software | Molecular Devices | — | SoftMax Pro 6.3 GxP |
| Incubator | Revco | 30482 | Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2 |
| Laminar Flow Hood | The Baker Company | 200256 | Baker SG603A-HE | High Efficiency, Class II Type A2 |
References
- Elmore, S. Apoptosis: A Review of programmed cell death. Toxicol Patho. 35 (4), 495-516 (2007).
- Darwish, R. S. Regulatory mechanisms of apoptosis in regularly dividing cells. Cell Health Cytoskelet. 2 (1), 59-68 (2010).
- Tracey, D., et al. Tumor necrosis factor antagonist mechanism of action: A comprehensive review. Pharmacol Ther. 117 (2), 244-279 (2008).
- Körner, H., Sedgwick, J. Tumour necrosis factor and lymphotoxin: Molecular aspects and role in tissue-specific autoimmunity. Immunol Cell Biol. 74 (5), 465-472 (1996).
- Wong, M., et al. TNFa blockade in human diseases: Mechanisms and future directions. Clin Immunol. 126 (2), 121-136 (2008).
- Furst, D. E., Wallis, R., Broder, M., Beenhouwer, D. O. Tumor necrosis factor antagonists: different kinetics and/or mechanisms of action may explain differences in the risk for developing granulomatous infection. Semin Arthritis Rheum. 36 (3), 159-167 (2006).
- Karvinen, J., et al. Homogeneous time-resolved fluorescence quenching assay (LANCE) for caspase-3. J Biomol Screen. 7 (3), 223-231 (2002).
- Ren, Y. G., et al. Differential regulation of the TRAIL death receptors DR4 and DR5 by the signal recognition particle. Mol Biol Cell. 15 (11), 5064-5074 (2004).
- Sud, D., Bigbee, C., Flynn, J. L., Kirschner, D. E. Contribution of CD8+ T cells to control of Mycobacterium tuberculosis infection. J Immunol. 176 (7), 4296-4314 (2006).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Apendix 3, 3 (2001).
- Ramasubramanyan, N., et al. . Low acidic species compositions and methods for producing and using the same. 1, (2014).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
- Eskandari, M. K., Nguyen, D. T., Kunkel, S. L., Remick, D. G. WEHI 164 subclone 13 assay for TNF: sensitivity, specificity, and reliability. Immunol Invest. 19 (1), 69-79 (1990).
- Hora, M. S., Rana, R. K., Smith, F. W. Lyophilized formulations of recombinant tumor necrosis factor. Pharm Res. 9 (1), 33-36 (1992).
- Ponnappan, S., Ponnappan, U. Aging and immune function: molecular mechanisms to interventions. Antiox Redox Signal. 14 (8), 1551-1585 (2011).
- Matsumaru, K., Ji, C., Kaplowitz, N. Mechanisms for sensitization to TNF-induced apoptosis by acute glutathione depletion in murine hepatocytes. Hepatology. 37 (6), 1425-1434 (2003).
- Camacho-Villegas, T., Mata-Gonzalez, T., Paniagua-Solis, J., Sanchez, E., Licea, A. Human TNF cytokine neutralization with a vNAR from Heterodontus francisci shark: a potential therapeutic use. mAbs. 5 (1), 80-85 (2013).
- Männel, D. N., Falk, W. Optimal induction of tumor necrosis factor production in human monocytes requires complete S-form lipopolysaccharide. Infect Immun. 57 (7), 1953-1958 (1989).
- Lis, K., Kuzawińska, O., Bałkowiec-Iskra, E. Tumor necrosis factor inhibitors-state of knowledge. Arch Med Sci. 10 (6), 1175-1185 (2014).
