Bir protokol WEHI 164 hücrelerle nötralizasyon mekanizmasını kullanarak bir anti-TNFα mAb göreli anti-apoptotik aktivitesinin belirlenmesi için burada sunulan. Bu iletişim kuralı ile aynı biyolojik işlevi farklı molekül nötralizasyon gücünü karşılaştırmak için yararlıdır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Göreceli güç, bir Anti-TNF Monoklonal antikor (mAb) Neutralizing In Vitro Bioanalytical yöntemini kullanarak TNF tarafından belirlenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Bu iletişim kuralı TNFα apoptotik etkinlik nötralize ölçümü bir anti-TNFα mAb kullanarak bir fare fibroblast hücre modelinde (WEHI 164) gösterir. Ayrıca, bu iletişim kuralı başka anti-TNFα moleküllerin, füzyon protein değerlendirmek için kullanılabilir. Ne zaman bir ek stres faktörü hücre kültür koşulları (Örneğin, serum yoksunluk) indüklenen hücresel modeli burada istihdam TNFα aracılı apoptosis duyarlıdır. Bu yordamı nasıl numune hazırlama, hücre seyreltme, Apoptozis indüksiyon ve başarılı sonuçlar sağlamak için kritik olan spektrofotometrik ölçümler ilgili anahtar işlemleri vurgulayarak bu analitik tahlil çalıştırmak için örneğidir. Bu iletişim kuralı apoptosis indüksiyon ve kayıt, düşük belirsizlik değerleri için önde gelen verimli sinyal ile ilgili en iyi performans koşullar ortaya koymaktadır.
Giriş
Biyolojik etki gücüne (kütle birimi cinsinden) miktarını protein içeriği fizikokimyasal bir ölçüsüdür, ancak ilgili biyolojik özellikleri için bağlı olan bölümü ürün öznitelikleri temel biyolojik aktivitesi niceliksel ölçüsüdür. KUDRET testleri, analitik diğer yöntemlerden ürün uygunluk, istikrar ve karşılaştırılabilir çalışmaları kapsamında gerçekleştirilir. Bu anlamda, kudret ölçümler ürün toplu işlemleri tüm aşamada klinik denemeler ve Pazar onaylandıktan sonra sırasında kritik kalite öznitelikleri (CQAs) veya kabul kriterlerini karşılamak olduğunu göstermek için kullanılır.
Apoptozis programlanmış hücre ölümü, hücreler hücreleri bir çev....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. medya ve çözümleri hazırlanması
- kültür ortamı hazırlamak: RPMI-%1640 10 ile FBS, pH 7.4.
- Hazırlama tahlil kültür orta: RPMI-1640 fenol red olmadan ancak % 1'ile FBS, pH 7.4.
- Hücre yıkama çözüm hazırlamak: DPBS Mg ve Ca ücretsiz Çözümle %0.02 EDTA, pH 7.4.
- Hücre dekolmanı çözümü hazırlamak: %0.125 tripsin ile 1 mM EDTA.
- % 0.25 çözüm tripsin-EDTA ve transfer steril bir 500 mL şişe 100 mL çözülme.
- Mix hücrenin 100 mL ile çözüm yıkama ve 15 mL aliquots 15 mL steril tüpler içine dağıtmak. -70-80 ° C kadar kullanım için mağaza.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Doz-yanıt grafik (Denetim) içeren
Şekil 1 ışıldama yanıt mAb konsantrasyon karşı temsil eder. Bu sigmoidal işlev caspase 3 ve 7 Yayın tahlil kültür Orta hücre lizis nedeniyle örneğidir. Hücre ölümü serum açlık artı indüksiyon sinyal TNFα tarafından geliştirilmiştir. Bu nedenle, anti-TNFα molekül (mAb) TNF hücre reseptörü ile etkileşimi (steric engel tarafından) inhibe sitokin ile etkileşim kurar. Bu hücre yaşam daha yüksek mAb konsantrasy.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu karakterizasyonu pahalı ve zaman alıcı klinik yürütülen önce bir temanın bir molekül geliştiriliyor biyolojik davranışını belirlemek için yardımcı olur. Ayrıca bir onaylı uyuşturucu ürün toplu iş toplu iş serbest bırakmak için yararlıdır. Bu deneyleri bir molekül onun etki mekanizmaları ile ilgili yeterli bir biyolojik etkisi varsa belirlemek için yararlıdır kayda değer olduğunu. Bu eğitimde sunulan bio analitik yöntem kritik farklı anti-TNFα molekülleri karşılaştırma için önemlidir. Ortak fizikokimyasal yönt.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa yoktur
Teşekkürler
Bu eser Ulusal Bilim Konseyi tarafından desteklenen ve Teknoloji (CONACYT), Meksika PEI CONACYT 2015 220333, çalışma tasarım katılımı olmadan verin.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| WEHI 164 | ATCC | CRL-1751 | Mus musculus'tan fibrosarkom hücreleri |
| RPMI-1640 Orta | ATCC | 30-2001 | Ortamı 2 derecede saklayın; C ila 8 derece > C |
| RPMI 1640 Orta, fenol kırmızısı yok | GIBCO | 11835-030 | Ortamı 2 ° C'de saklayın; C ila 8 derece > C |
| Tripsin-EDTA (% 0.25), fenol kırmızısı | GIBCO | 25200-056 | Ortamı -10 ° C'de saklayın; C ila -20 derece > C |
| DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok | GIBCO | 14190-136 | Ortamı 2 ° C'de saklayın; C ila 8 derece > C |
| Rekombinant İnsan TNF-alfa Proteini R | & D Systems | 210-TA-020 | -20 > C ila -70 derece > C |
| Fetal Sığır Serumu (ABD), Süper Düşük IgG | HyClone | SH3089803 | -10 ° C'de saklayın; C ila -20 derece > C |
| Fetal Sığır Serumu (ABD), - | HyClone | SH3007103 | Deposu; C ila -20 derece > C |
| Caspase-Glo 3/7 Test kiti | Promega | G8093 | Caspase-Glo'yu saklayın. 3/7 substrat ve kaspaz-glo. 3/7 &ndash'ta tampon; 20 >m; C korumalı Hafif |
| EDTA, Disodyum Tuzu, Dihidrat, Kristal, ACS Reaktifi | JTbaker | 8993-01 | - |
| Örnek mAb Adalimumab | Probiomed | NA | Mikroplakadaki nihai konsantrasyonlar: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 ve 0.004 μ g / mL |
| Referans ve Kontrol mAb Adalimumab | Abbvie | NA | Mikroplakadaki nihai konsantrasyonlar: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 ve 0.004 μ g / mL |
| Mikroplaka Okuyucu | Moleküler Cihazlar | 89429-536 | SpectraMax M3 Çok Modlu |
| Mikroplaka okuyucu Yazılımı | Moleküler Cihazlar | - | SoftMax Pro 6.3 GxP |
| İnkübatör ve nbsp; | Revco | 30482 | Revco RNW3000TABB Cebri Hava CO2 |
| Laminer Akış Başlığı | Fırıncı Şirketi | 200256 | Fırıncı SG603A-HE | Yüksek Verimlilik, Sınıf II Tip A2 |
Kaynaklar
- Elmore, S. Apoptosis: A Review of programmed cell death. Toxicol Patho. 35 (4), 495-516 (2007).
- Darwish, R. S. Regulatory mechanisms of apoptosis in regularly dividing cells. Cell Health Cytoskelet. 2 (1), 59-68 (2010).
- Tracey, D., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
