Göreceli güç, bir Anti-TNF Monoklonal antikor (mAb) Neutralizing In Vitro Bioanalytical yöntemini kullanarak TNF tarafından belirlenmesi
Summary
Bir protokol WEHI 164 hücrelerle nötralizasyon mekanizmasını kullanarak bir anti-TNFα mAb göreli anti-apoptotik aktivitesinin belirlenmesi için burada sunulan. Bu iletişim kuralı ile aynı biyolojik işlevi farklı molekül nötralizasyon gücünü karşılaştırmak için yararlıdır.
Abstract
Bu iletişim kuralı TNFα apoptotik etkinlik nötralize ölçümü bir anti-TNFα mAb kullanarak bir fare fibroblast hücre modelinde (WEHI 164) gösterir. Ayrıca, bu iletişim kuralı başka anti-TNFα moleküllerin, füzyon protein değerlendirmek için kullanılabilir. Ne zaman bir ek stres faktörü hücre kültür koşulları (Örneğin, serum yoksunluk) indüklenen hücresel modeli burada istihdam TNFα aracılı apoptosis duyarlıdır. Bu yordamı nasıl numune hazırlama, hücre seyreltme, Apoptozis indüksiyon ve başarılı sonuçlar sağlamak için kritik olan spektrofotometrik ölçümler ilgili anahtar işlemleri vurgulayarak bu analitik tahlil çalıştırmak için örneğidir. Bu iletişim kuralı apoptosis indüksiyon ve kayıt, düşük belirsizlik değerleri için önde gelen verimli sinyal ile ilgili en iyi performans koşullar ortaya koymaktadır.
Introduction
Biyolojik etki gücüne (kütle birimi cinsinden) miktarını protein içeriği fizikokimyasal bir ölçüsüdür, ancak ilgili biyolojik özellikleri için bağlı olan bölümü ürün öznitelikleri temel biyolojik aktivitesi niceliksel ölçüsüdür. KUDRET testleri, analitik diğer yöntemlerden ürün uygunluk, istikrar ve karşılaştırılabilir çalışmaları kapsamında gerçekleştirilir. Bu anlamda, kudret ölçümler ürün toplu işlemleri tüm aşamada klinik denemeler ve Pazar onaylandıktan sonra sırasında kritik kalite öznitelikleri (CQAs) veya kabul kriterlerini karşılamak olduğunu göstermek için kullanılır.
Apoptozis programlanmış hücre ölümü, hücreler hücreleri bir çevre tarafından stresli olduğunda veya bir virüs ile enfekte doğal olarak meydana gelen faktör bu uzlaşma hücresel canlılığı ve işlev1,2. Diğerleri arasında Apoptozis inhibisyon veya biyolojik nötralizasyon, mAbs, özellikle immün aracılı enflamatuar bozuklukları gibi kronik hastalıkların tedavisinde esas olarak bilinen tedavi mekanizmaları biridir. Anti-TNFα molekülleri onların tedavi edici özellikleri tümör nekrozis faktör alfa (TNFα) arasındaki etkileşimin engelleyerek böylece nihayet için hücresel apoptosis kurşun sinyal yolları engelleyen p55 ve p75 hücre yüzey reseptörleri ile3, uygulamayın.
TNFα iltihap bazı kronik hastalıklar4üretebilir. TNFα spuriously ekstraselüler ortamın nöbetçiler doğuştan gelen bağışıklık sistemi ve bu tür hastalık5ana oyuncular makrofajlar tarafından salgılanan. Ortak bir yol, TNFα deregülasyon bu hastalıkların patogenezinde ile ilişkilidir. Kontrol etmeden ve sürekli indüksiyon ve hücre stres altında TNFα sonuçta leading romatoid artrit, Crohn hastalığı ve diğer patolojik profilleri6hücre ölüm ve doku dejenerasyonu, neden olmaktadır.
TNF ve onun reseptörleri arasındaki etkileşimi engellemek TNF antagonistleri giderek belirtiler azaltmak ve bu hastalıkların ilerlemesini engellemek için etkili bir tedavi olarak kullanılmıştır. Günümüzde, anti-TNFα ilaç ürünleri yaygın olarak böylece daha fazla yer doku dejenerasyonu engelleyen bu sitokin sistemik konsantrasyonu denetlemek için kullanılır. Bu anlamda, onun biyolojik etkiyi elde etmek için bir ilaç belirli yeteneğini açıklamak için tekrarlanabilir ve sağlam bir bioassay sağlanması şarttır.
Bu protokol, kritik adımlar-nötralizasyon tahlil geliştirilmesi sırasında tespit-bio analitik yöntem yürütmek için gerekli becerileri özel bir vurgu ile biyolojik etki gücü başarılı ölçüm için vurgulanır. Bu bio analitik yöntem bir klinik olarak test edilmiş başvuru madde karşılaştırıldığında ilaç ürünleri farklı toplu işlemleri veya anti-TNFα arasında yararlı karşılaştırılabilir bilgi sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu karakterizasyonu pahalı ve zaman alıcı klinik yürütülen önce bir temanın bir molekül geliştiriliyor biyolojik davranışını belirlemek için yardımcı olur. Ayrıca bir onaylı uyuşturucu ürün toplu iş toplu iş serbest bırakmak için yararlıdır. Bu deneyleri bir molekül onun etki mekanizmaları ile ilgili yeterli bir biyolojik etkisi varsa belirlemek için yararlıdır kayda değer olduğunu. Bu eğitimde sunulan bio analitik yöntem kritik farklı anti-TNFα molekülleri karşılaştır…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Ulusal Bilim Konseyi tarafından desteklenen ve Teknoloji (CONACYT), Meksika PEI CONACYT 2015 220333, çalışma tasarım katılımı olmadan verin.
Materials
| WEHI 164 | ATCC | CRL-1751 | Fibrosarcoma cells from Mus musculus |
| RPMI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| RPMI 1640 Medium, no phenol red | GIBCO | 11835-030 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| Trypsin-EDTA(0.25%),phenol red | GIBCO | 25200-056 | Store medium at -10 °C to -20 °C |
| DPBS, no calcium, no magnesium | GIBCO | 14190-136 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| Recombinant Human TNF-alpha Protein | R&D Systems | 210-TA-020 | Store at -20 °C to -70 °C |
| Fetal Bovine Serum (U.S), Super Low IgG | HyClone | SH3089803 | Store at -10 °C to -20 °C |
| Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized | HyClone | SH3007103 | Store at -10 °C to -20 °C |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8093 | Store the Caspase-Glo. 3/7 Substrate and Caspase-Glo. 3/7 Buffer at –20 ºC protected fromLight |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. Reagent | J.T.Baker | 8993-01 | — |
| Sample mAb Adalimumab | Probiomed | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
| Reference and Control mAb Adalimumab | Abbvie | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 | SpectraMax M3 Multi-Mode |
| Microplate reader Software | Molecular Devices | — | SoftMax Pro 6.3 GxP |
| Incubator | Revco | 30482 | Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2 |
| Laminar Flow Hood | The Baker Company | 200256 | Baker SG603A-HE | High Efficiency, Class II Type A2 |
References
- Elmore, S. Apoptosis: A Review of programmed cell death. Toxicol Patho. 35 (4), 495-516 (2007).
- Darwish, R. S. Regulatory mechanisms of apoptosis in regularly dividing cells. Cell Health Cytoskelet. 2 (1), 59-68 (2010).
- Tracey, D., et al. Tumor necrosis factor antagonist mechanism of action: A comprehensive review. Pharmacol Ther. 117 (2), 244-279 (2008).
- Körner, H., Sedgwick, J. Tumour necrosis factor and lymphotoxin: Molecular aspects and role in tissue-specific autoimmunity. Immunol Cell Biol. 74 (5), 465-472 (1996).
- Wong, M., et al. TNFa blockade in human diseases: Mechanisms and future directions. Clin Immunol. 126 (2), 121-136 (2008).
- Furst, D. E., Wallis, R., Broder, M., Beenhouwer, D. O. Tumor necrosis factor antagonists: different kinetics and/or mechanisms of action may explain differences in the risk for developing granulomatous infection. Semin Arthritis Rheum. 36 (3), 159-167 (2006).
- Karvinen, J., et al. Homogeneous time-resolved fluorescence quenching assay (LANCE) for caspase-3. J Biomol Screen. 7 (3), 223-231 (2002).
- Ren, Y. G., et al. Differential regulation of the TRAIL death receptors DR4 and DR5 by the signal recognition particle. Mol Biol Cell. 15 (11), 5064-5074 (2004).
- Sud, D., Bigbee, C., Flynn, J. L., Kirschner, D. E. Contribution of CD8+ T cells to control of Mycobacterium tuberculosis infection. J Immunol. 176 (7), 4296-4314 (2006).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Apendix 3, 3 (2001).
- Ramasubramanyan, N., et al. . Low acidic species compositions and methods for producing and using the same. 1, (2014).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
- Eskandari, M. K., Nguyen, D. T., Kunkel, S. L., Remick, D. G. WEHI 164 subclone 13 assay for TNF: sensitivity, specificity, and reliability. Immunol Invest. 19 (1), 69-79 (1990).
- Hora, M. S., Rana, R. K., Smith, F. W. Lyophilized formulations of recombinant tumor necrosis factor. Pharm Res. 9 (1), 33-36 (1992).
- Ponnappan, S., Ponnappan, U. Aging and immune function: molecular mechanisms to interventions. Antiox Redox Signal. 14 (8), 1551-1585 (2011).
- Matsumaru, K., Ji, C., Kaplowitz, N. Mechanisms for sensitization to TNF-induced apoptosis by acute glutathione depletion in murine hepatocytes. Hepatology. 37 (6), 1425-1434 (2003).
- Camacho-Villegas, T., Mata-Gonzalez, T., Paniagua-Solis, J., Sanchez, E., Licea, A. Human TNF cytokine neutralization with a vNAR from Heterodontus francisci shark: a potential therapeutic use. mAbs. 5 (1), 80-85 (2013).
- Männel, D. N., Falk, W. Optimal induction of tumor necrosis factor production in human monocytes requires complete S-form lipopolysaccharide. Infect Immun. 57 (7), 1953-1958 (1989).
- Lis, K., Kuzawińska, O., Bałkowiec-Iskra, E. Tumor necrosis factor inhibitors-state of knowledge. Arch Med Sci. 10 (6), 1175-1185 (2014).
