Bestämning av den relativa styrkan av en Anti-TNF monoklonal antikropp (mAb) av Neutralizing TNF med hjälp av In Vitro bioanalytisk metod
Summary
Ett protokoll för bestämning av den relativa anti-apoptotiska effekten av en anti-TNFα mAb med en neutralisering mekanism med WEHI 164 celler presenteras här. Detta protokoll är användbara för att jämföra styrkan neutralisering av olika molekyler med samma biologiska funktioner.
Abstract
Detta protokoll visar mätningen av apoptotiska aktivitet neutralizationen av TNFα i en mus fibroblast cell modell (WEHI 164) med en anti-TNFα-mAb. Detta protokoll kan dessutom användas för att utvärdera andra anti-TNFα molekyler, såsom fusionsproteinerna. Den cellulära modell som anställd här är känslig för TNFα-medierad apoptos när en ytterligare stressfaktor induceras i cell kultur förhållanden (t.ex. serum deprivation). Detta förfarande exemplifierar hur man utföra detta analytiska assay, lyfta fram viktiga åtgärder avseende den provberedning, cell utspädning, apoptos induktion och spektrofotometrisk mätning som är avgörande för att säkerställa lyckade resultat. Detta protokoll avslöjar bästa prestanda villkoren för apoptos induktion och effektiv signal inspelning, vilket leder till låg mätosäkerhet värden.
Introduction
Biologisk potens är de kvantitativa måttet på biologisk aktivitet baserat på analyseras produktattribut som är länkade till de relevanta biologiska egenskaperna, kvantitet (uttryckt i massa) är en fysikalisk-kemisk åtgärd av proteinhalten. Potens tester, tillsammans med andra analytiska metoder, utförs som en del av produktens överensstämmelse, stabilitet och jämförbara studier. I denna mening används potens mätningar som visar att produkten batchar uppfylla den kritiska kvalitetsattribut (CQAs) eller acceptanskriterier under alla faser av kliniska prövningar och efter marknadsgodkännande.
Apoptos är programmerad celldöd, naturligt förekommande när celler är infekterad med ett virus eller när cellerna är stressade av en miljömässig faktor att kompromisser cellulära livskraft och funktion1,2. Bland annat är apoptos hämning eller biologisk neutralisation, en av de främst kända terapeutiska mekanismerna av mAbs, särskilt vid behandling av kroniska sjukdomar, såsom immunmedierade inflammatoriska sjukdomar. Anti-TNFα molekyler utöva sina terapeutiska egenskaper genom att blockera växelverkan av tumörnekrosfaktor alfa (TNFα) med p55 och p75 cell surface receptorer3, därmed förhindra signalvägar som slutligen leder till cellulära apoptos.
TNFα kan producera inflammation i vissa kroniska sjukdomar4. TNFα utsöndras förevändningar i den extracellulära miljön av makrofager, som vakter av det medfödda immunsystemet och de huvudsakliga aktörerna i denna typ av sjukdom5. Som en gemensam väg förknippas TNFα avreglering med patogenesen av dessa sjukdomar. Utan kontroll och under konstant induktion och cell stress inducerar TNFα cell death och vävnad degeneration, vilket slutligen leder till reumatoid artrit, Crohns sjukdom och andra patologiska profiler6.
TNF-antagonister som blockerar interaktionen mellan TNF och dess receptorer har använts alltmer som en effektiv behandling att minska symtomatologi och hindra progressionen av dessa sjukdomar. Anti-TNFα drog produkter används numera allmänt att styra den systemiska koncentrationen av denna cytokin, därmed förhindra ytterligare degeneration av berörda vävnader. I denna mening är det absolut nödvändigt att ge en reproducerbar och robust bioassay för att beskriva en drog specifika förmåga att uppnå sin biologiska effekt.
I detta protokoll, kritiska steg-identifierade under utvecklingen av en neutralization assay-för framgångsrik mätning av biologisk potens är markerade, med särskild tonvikt på den kompetens som behövs för att köra de bioanalytiska metoden. Bioanalytiska metoden ger användbar jämförbarhet information mellan olika partier eller anti-TNFα läkemedel jämfört med ett kliniskt testat referensämne.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna karakterisering hjälper till att bestämma en priori den biologiska beteenden av en molekyl under utveckling innan dyra och tidskrävande kliniska prövningar genomförs. Det är också användbart för batch-till-frisläppande av tillverkningssats av en produkt som godkända läkemedel. Det är värt att nämna att dessa analyser är användbara för att avgöra om en molekyl har en tillräcklig biologisk effekt om dess verkningsmekanism. Den bio-analytiska metod som presenteras i denna handledning är k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av det nationella rådet för vetenskap och teknik (CONACYT), Mexiko bevilja PEI CONACYT 2015 220333, utan deltagande i utformningen av studien.
Materials
| WEHI 164 | ATCC | CRL-1751 | Fibrosarcoma cells from Mus musculus |
| RPMI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| RPMI 1640 Medium, no phenol red | GIBCO | 11835-030 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| Trypsin-EDTA(0.25%),phenol red | GIBCO | 25200-056 | Store medium at -10 °C to -20 °C |
| DPBS, no calcium, no magnesium | GIBCO | 14190-136 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| Recombinant Human TNF-alpha Protein | R&D Systems | 210-TA-020 | Store at -20 °C to -70 °C |
| Fetal Bovine Serum (U.S), Super Low IgG | HyClone | SH3089803 | Store at -10 °C to -20 °C |
| Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized | HyClone | SH3007103 | Store at -10 °C to -20 °C |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8093 | Store the Caspase-Glo. 3/7 Substrate and Caspase-Glo. 3/7 Buffer at –20 ºC protected fromLight |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. Reagent | J.T.Baker | 8993-01 | — |
| Sample mAb Adalimumab | Probiomed | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
| Reference and Control mAb Adalimumab | Abbvie | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 | SpectraMax M3 Multi-Mode |
| Microplate reader Software | Molecular Devices | — | SoftMax Pro 6.3 GxP |
| Incubator | Revco | 30482 | Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2 |
| Laminar Flow Hood | The Baker Company | 200256 | Baker SG603A-HE | High Efficiency, Class II Type A2 |
References
- Elmore, S. Apoptosis: A Review of programmed cell death. Toxicol Patho. 35 (4), 495-516 (2007).
- Darwish, R. S. Regulatory mechanisms of apoptosis in regularly dividing cells. Cell Health Cytoskelet. 2 (1), 59-68 (2010).
- Tracey, D., et al. Tumor necrosis factor antagonist mechanism of action: A comprehensive review. Pharmacol Ther. 117 (2), 244-279 (2008).
- Körner, H., Sedgwick, J. Tumour necrosis factor and lymphotoxin: Molecular aspects and role in tissue-specific autoimmunity. Immunol Cell Biol. 74 (5), 465-472 (1996).
- Wong, M., et al. TNFa blockade in human diseases: Mechanisms and future directions. Clin Immunol. 126 (2), 121-136 (2008).
- Furst, D. E., Wallis, R., Broder, M., Beenhouwer, D. O. Tumor necrosis factor antagonists: different kinetics and/or mechanisms of action may explain differences in the risk for developing granulomatous infection. Semin Arthritis Rheum. 36 (3), 159-167 (2006).
- Karvinen, J., et al. Homogeneous time-resolved fluorescence quenching assay (LANCE) for caspase-3. J Biomol Screen. 7 (3), 223-231 (2002).
- Ren, Y. G., et al. Differential regulation of the TRAIL death receptors DR4 and DR5 by the signal recognition particle. Mol Biol Cell. 15 (11), 5064-5074 (2004).
- Sud, D., Bigbee, C., Flynn, J. L., Kirschner, D. E. Contribution of CD8+ T cells to control of Mycobacterium tuberculosis infection. J Immunol. 176 (7), 4296-4314 (2006).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Apendix 3, 3 (2001).
- Ramasubramanyan, N., et al. . Low acidic species compositions and methods for producing and using the same. 1, (2014).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
- Eskandari, M. K., Nguyen, D. T., Kunkel, S. L., Remick, D. G. WEHI 164 subclone 13 assay for TNF: sensitivity, specificity, and reliability. Immunol Invest. 19 (1), 69-79 (1990).
- Hora, M. S., Rana, R. K., Smith, F. W. Lyophilized formulations of recombinant tumor necrosis factor. Pharm Res. 9 (1), 33-36 (1992).
- Ponnappan, S., Ponnappan, U. Aging and immune function: molecular mechanisms to interventions. Antiox Redox Signal. 14 (8), 1551-1585 (2011).
- Matsumaru, K., Ji, C., Kaplowitz, N. Mechanisms for sensitization to TNF-induced apoptosis by acute glutathione depletion in murine hepatocytes. Hepatology. 37 (6), 1425-1434 (2003).
- Camacho-Villegas, T., Mata-Gonzalez, T., Paniagua-Solis, J., Sanchez, E., Licea, A. Human TNF cytokine neutralization with a vNAR from Heterodontus francisci shark: a potential therapeutic use. mAbs. 5 (1), 80-85 (2013).
- Männel, D. N., Falk, W. Optimal induction of tumor necrosis factor production in human monocytes requires complete S-form lipopolysaccharide. Infect Immun. 57 (7), 1953-1958 (1989).
- Lis, K., Kuzawińska, O., Bałkowiec-Iskra, E. Tumor necrosis factor inhibitors-state of knowledge. Arch Med Sci. 10 (6), 1175-1185 (2014).
