マウス精母細胞から減数分裂期染色体の準備をスプレッドします。
Summary
減数分裂は、DNA 複製の単一の円形および染色体の 2 つの連続したラウンドを経て、配偶子が形成される過程です。哺乳類の減数分裂は、減数分裂期染色体のスプレッドを準備する技術を活用して調べることができます。ここでは、表面拡散マウス精母細胞から核を準備する方法を示します。
Abstract
哺乳類の減数分裂は、生殖細胞の発生し勉強でき、特徴と動的過程です。メソッドを使用してスライドの表面に核を拡散 (ドロップの高さから) ではなく 1997 年に最初に記述されたマウス精母細胞に最適化手法を示します。広く用いられる前期 I. 精のサブステージを受けている高品質の核の茄多が増すので、哺乳類の減数分裂を研究する研究室で尿細管はまずにうねり精母細胞を低張液に配置されます。精母細胞は、細胞懸濁液を作成するショ糖液中に放出され、核に固定液に浸したガラス スライド上に広がっています。免疫染色、続いて減数分裂のプロセスに密接に関連蛋白質の多様性を調べることができます。たとえば、減数分裂、同族体の染色体軸/コアを一緒に接続する三者構造のタンパク質を簡単に視覚化できます。減数分裂組み換え蛋白質の相同組み換えによる DNA 二重鎖切断の修復に関与しているには前期の進行を評価する immunostained することができます私。ここで我々 の説明し、サンプルの詳細少年や成人男性マウスから精母細胞の減数分裂を哺乳類の研究に広く用いられる手法です。
Introduction
マウスは、哺乳類における減数分裂を勉強するモデル生物として広く使用されます。通常の発達プロセスと減数分裂の間に発生する欠陥の両方を評価できます。タイムラインと減数分裂の制御に重要なプロセスに関与する特定の蛋白質の多数と同様に、私は、サブステージ、前期中に発生する顕著な特徴の進行は、野生型と変異マウスの両方で特徴付けられます。減数分裂 (ヘンデルと Schimenti1レビュー) 詳細に勉強中に発生するいくつかの専門にされたプロセス。DNA 二重鎖切断 (DSB) の形成と修復、再結合、減数分裂形成と染色体分配が含まれます。
減数分裂のプロセスを学習の重要な側面は、視覚的および光学的により良い解決される含んでいる相同染色体を区別し、私は 5 のサブステージから成る I. 前期前期のサブステージを識別する核を調べる能力減数分裂 (SC) の形成を含む特定の機能が特徴です。SC は、ペアリングできるようにする三者タンパク質足場と同族体の DNA 二重鎖切断修復です。Leptonema、中に同族体揃える SC の軸要素が定められています。Zygonema 中に、減数分裂にアタッチする中心的な要素とは、同族体のペア間のペアリングおよび物理的な接続 (シナプス) を促進します。Pachynema、中に同族体のシナプスが完全になるし、DNA のクロス オーバーが相同組換えを介して DNA 二重鎖切断の修復から形成されています。SC は、desynapse が彼らのセントロメアおよび DNA のクロス オーバーのサイトで接続されたまま同族体を許可する diplonema、中に逆アセンブルします。最後に、移動中に同族体 recondense、中期への移行は、1を発生します。
歴史的には、前期の初期段階からの特にそれらいくつかの核をもたらした減数分裂期の染色質の表面拡散私2。その結果、これらのメソッドは、(睾丸、卵巣) の組織からの細胞の分離、拡散の減数分裂クロマチンの手法と評価2,3,の高品質減数分裂核の収量を改善するために変更されました。4します。 さらに、このメソッドが核保持に有用であることが証明、公開タバコプロトプ テクニック5,6,7で示されるように、クロマチンが減数分裂核タンパク質をバインドします。したがって、メソッドは当初ピーターズ2で記述し、前期の leptotene、zygotene、pachytene、diplotene、および移動のサブステージを受けている同族体を含む多くの独立したバースト精母細胞核の利回りを示す私。
表面拡散核 (クロマチンのスペクトラム解析とも呼ばれます) の準備の技術、広く減数分裂生殖、細胞生物学の分野での研究に使用されます。表面拡散核を含むスライドは興味の蛋白質に抗体と immunostained をその後することができますまたは銀染色に服従し、顕微鏡で解析。メソッドは、雌マウス2の変更が記載されているが、男性と女性の両方のマウスと似ています。精細管を overmince ことが重要です。免疫染色の同族体を後にその核必要がありますも広がりも、関連付けられているタンパク質が顕微鏡で見えます。表面拡散核をわずか数時間でいずれかの immunostained すぐに準備または融解と免疫染色の前に 3 週間の最大-80 ° C で保存できます。ただし、最適な結果がすぐにまたは表面拡散核の準備の 2 週間以内に免疫染色を実行する場合いくつかの蛋白質の得最高。スライドは、興味の蛋白質に抗体を用いた標準的なプロトコルと immunostained をすることができます二次抗体を蛍光共役タンパク質や色素、培養で後蛍光顕微鏡8のイメージを作成します。生後 15-21 では、野生型 6-10 スライドを生成する精巣のペアあたり十分な組織と古いマウス (大人も含む) を行えば、さらにスライド。しかし、野生型マウス 6 週間以上も得られませんより後減数分裂細胞 (すなわち細胞) の免疫染色を次のスライド。さらに、前期のすべてサブステージ私観察できる少年と大人のマウス。生後 10 15 からで男性の精巣より多くの leptotene と zygotene の細胞を得られます。マウス生後 14 に 15 より古いより多くの pachytene と diplotene の核になります。
ここで我々 の説明し、サンプル マウス精母細胞から表面拡散核の準備の広く使われている方法です。
Protocol
Representative Results
Discussion
広がり、良い品質精母細胞核の高い数字を得るためには、このプロトコルの最も重要な手順なして、適切な精細管のミンチで精細管の適当な培養時間は含まし、技術を採用ショ糖細胞懸濁液を固結被覆スライドに します。我々 は生後 15 大人なしてに 45 分の比較的高齢者Chtf18から精巣中に至る野生型男性の精巣の精細管を孵化させなさい-null マウスはわずか 30 分インキュベート、精?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、アビゲイル ・ ハリス ・の技術的な支援を認めます。彼らはまたマウス精母細胞から表面拡散核の準備のプロトコルを最適化するを助けるためポーラ ・ コーエン、キム ・ ホロウェイを認めます。著者は、カレン シンドラーによって原稿の批判的読解を感謝しています。
この作品は NIH R01 GM106262 K.M.B. に支えられ
Materials
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution) | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 °C |
| Teflon printed 3 ring slides | Electron Microscopy Sciences | 63418-11 | |
| Premium uncharged frosted end glass slides | Several commercial brands | Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides | |
| Surgical scissors (sharp and blunt tips) | Fine Science Tools | 14001-12 | Different brand of a similar type will work |
| Fine tip surgical scissors (sharp tips) | Fine Science Tools | 14058-11 | Different brand of a similar type will work |
| Straight fine tip forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Different brand of a similar type will work |
| Curved medium tip forceps | Fisher | 16100110 | Different brand of a similar type will work |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Different brand of a similar type will work |
| Mouse anti-SYCP3 | Abcam | ab97672 | Use at 1:300 |
| Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum) | Antibodies Incorporated | 15-234-0001 | Use at 1:50 |
| Humidified chamber | We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels | ||
| Widefield microscope with epifluorescence | Leica microsystems | Any standard model | |
| Coplin jars | Several commercial brands | 50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back) | |
| Petri dishes | Several commercial brands | 100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated |
References
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