Preparación del cromosoma meiótico se extiende desde ratón espermatocitos
Summary
La meiosis es el proceso de desarrollo por que los gametos se forman a través de una sola ronda de replicación del ADN y dos series sucesivas de segregación cromosómica. Meiosis mamífera pueden examinarse mediante la utilización de una técnica para preparar extensiones de cromosoma meiótico. Aquí, demostramos un método de preparación de superficie de extensión núcleos de espermatocitos de ratón.
Abstract
Meiosis mamífera es un proceso dinámico del desarrollo que ocurre en las células de germen y puede ser estudiado y caracterizado. Usando un método para extender los núcleos en la superficie del portaobjetos (en lugar de dejarlos caer desde una altura), se demuestra una técnica optimizada en espermatocitos de ratón que primero fue descrita en 1997. Este método es ampliamente utilizado en laboratorios para el estudio de meiosis mamífera porque produce una gran cantidad de núcleos de alta calidad sometidos a subetapas de la profase I. seminíferos túbulos primero se colocan en una solución hipotónica a hincharse espermatocitos. Espermatocitos se lanzan en una solución de sacarosa para crear una suspensión de células y núcleos se extienden sobre portaobjetos de vidrio empapado de fijador. Después de inmunotinción, se puede examinar una diversidad de proteínas relacionadas a los procesos de meiosis. Por ejemplo, las proteínas del Complejo Sinaptonémico, una estructura tripartita que une los ejes de cromosoma/corazones de homólogos pueden visualizarse fácilmente. Las proteínas de la recombinación meiótica, que están implicadas en la reparación de roturas de doble cadena de DNA por recombinación homóloga, pueden también ser immunostained para evaluar la progresión de la profase I. Aquí describimos y mostrar en detalle una técnica ampliamente utilizada para el estudio de meiosis mamífera en espermatocitos de ratones machos jóvenes o adultos.
Introduction
Ratones se utilizan extensivamente como un organismo modelo para el estudio de meiosis en mamíferos. Pueden evaluar los procesos de desarrollo normales y defectos que ocurren durante la meiosis. El cronograma y la progresión de las características salientes que ocurren durante la profase I y subetapas, así como una multitud de proteínas específicas implicadas en procesos cruciales para la regulación de la meiosis se caracteriza en el tipo salvaje y mutantes ratones. Varios procesos especializados que ocurren durante la meiosis que puedo estudiarse en detalle (revisado en Handel y Schimenti1). Estos incluyen formación de rotura de doble cadena (DSB) de DNA y reparación, recombinación, formación del Complejo Sinaptonémico y segregación cromosómica.
Un aspecto importante del estudio de procesos meióticas es la capacidad de examinar los núcleos que contienen cromosomas homólogos que son visualmente y ópticamente decidieron mejor distinguieran e identifican las subetapas de la profase I. profase se compone de 5 subestadios se caracterizan por rasgos específicos incluyendo la formación del Complejo Sinaptonémico (SC). El SC es un andamio de proteína tripartita que permite sincronización y reparación de rotura de doble cadena de ADN de homólogos. Durante leptonema, homólogos alinean elementos axiales de la SC están establecidas. Entonces fijación de elementos centrales del Complejo Sinaptonémico durante zygonema facilita la sincronización y física conexión (sinapsis) entre pares de homólogos. Durante pachynema, synapsis de homólogos se convierte completo y cruces de ADN están formadas por reparación de una población selecta de roturas de doble cadena de DNA mediante recombinación homóloga. La SC se desarma en diplonema, permitiendo homólogos desynapse pero permanecer unido en sus centrómeros y en sitios de cruces de ADN. Finalmente durante la diacinesis, homólogos recondensen y la transición a la metafase produce1.
Históricamente, superficie-que se separa de la cromatina meiótica rindió pocos núcleos, especialmente los de las primeras etapas de la profase I2. Como resultado, estos métodos fueron modificados para mejorar la separación de las células de los tejidos (ovario o testículo), la técnica de la que se separa la cromatina meiótica y la producción de núcleos meiótica de alta calidad para evaluación2,3, 4. Además, este método demostró para ser útil en la preservación de nuclear y la cromatina encuadernado proteínas en núcleos meióticas según lo demostrado por técnicas de inmunolocalización publicado5,6,7. Por lo tanto, el método inicialmente descrito por Peters2 y demostrado aquí rendimientos muchos núcleos de espermatocito ráfaga separadas con homólogos en el leptoteno, anfiteno, paquiteno, diploteno y diacinesis subetapas de la profase I.
La técnica de preparación de núcleos de extensión de superficie (también llamados análisis de propagación de la cromatina) es ampliamente utilizada para el estudio de meiosis en los campos de la biología reproductiva y de la célula. Diapositivas que contienen núcleos de extensión de la superficie pueden ser posteriormente immunostained con anticuerpos a las proteínas de interés o sometidos a tinción de plata y luego analizan con microscopia. El método es similar para los ratones masculinos y femeninos, aunque se han descrito modificaciones para ratones hembra2. Es crucial no overmince los túbulos seminíferos. Núcleos deben también bien transmitirse para que tras inmunotinción homólogos y las proteínas asociadas claramente se observan con microscopia. Núcleos de extensión de la superficie pueden ser preparados en tan sólo unas horas y ya sea immunostained inmediatamente o almacenados a-80 ° C durante un máximo de 3 semanas antes de la descongelación y el immunostaining. Sin embargo, obtener resultados óptimos se obtienen mejor para algunas proteínas si inmunotinción se realiza inmediatamente o dentro de 2 semanas de preparación de núcleos de extensión de la superficie. Diapositivas pueden ser immunostained con un protocolo estándar usando los anticuerpos a las proteínas de interés, seguido por la incubación con anticuerpos secundarios conjugados a fluorescente proteínas o tintes, luego imágenes con fluorescencia microscopía8. En el día postnatal 15-21 hay suficiente tejido por cada par de testículos de tipo salvaje para producir diapositivas 6 a 10, y ratones mayores (incluyendo a adultos) dan más diapositivas. Sin embargo, ratones de tipo salvaje 6 semanas de edad y mayores también producirá más post meiosis células (es decir, espermátidas) en las diapositivas siguientes immunostaining. Además, todos los subestadios de profase puedo observarse en ratones adultos y juveniles. Los testículos de machos en postnatales días 10 al 15, obtendrá muchas más células leptoteno y anfiteno. Mayores de día postnatal 14 a 15 ratones producirá más núcleos paquiteno y diploteno.
Aquí describimos y demostrar un método ampliamente utilizado de la preparación de superficie de extensión núcleos de espermatocitos de ratón.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para obtener un número elevado de núcleos de espermatocito bien extendidas, buena calidad, los pasos más críticos de este protocolo incluyen el tiempo de incubación apropiados de los túbulos seminíferos en HEB, apropiado picado de túbulos seminíferos, y la técnica empleada para distribuyen la suspensión de células de sacarosa en el fijador diapositivas revestido. Incuban los túbulos seminíferos de los testículos de los machos de tipo salvaje desde día postnatal 15 a la edad adulta en HEB por 45 min, mient…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen la asistencia técnica de Abigail Harris. También reconoce Paula Cohen y Kim Holloway para ayudar a optimizar el protocolo de preparación de superficie de extensión núcleos de espermatocitos de ratón. Los autores también aprecian la lectura crítica del manuscrito por Karen Schindler.
Este trabajo fue financiado por los NIH R01 GM106262 a K.M.B.
Materials
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution) | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 °C |
| Teflon printed 3 ring slides | Electron Microscopy Sciences | 63418-11 | |
| Premium uncharged frosted end glass slides | Several commercial brands | Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides | |
| Surgical scissors (sharp and blunt tips) | Fine Science Tools | 14001-12 | Different brand of a similar type will work |
| Fine tip surgical scissors (sharp tips) | Fine Science Tools | 14058-11 | Different brand of a similar type will work |
| Straight fine tip forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Different brand of a similar type will work |
| Curved medium tip forceps | Fisher | 16100110 | Different brand of a similar type will work |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Different brand of a similar type will work |
| Mouse anti-SYCP3 | Abcam | ab97672 | Use at 1:300 |
| Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum) | Antibodies Incorporated | 15-234-0001 | Use at 1:50 |
| Humidified chamber | We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels | ||
| Widefield microscope with epifluorescence | Leica microsystems | Any standard model | |
| Coplin jars | Several commercial brands | 50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back) | |
| Petri dishes | Several commercial brands | 100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated |
References
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Counce, S. J., Meyer, G. F. Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy. Chromosoma. 44, 231-253 (1973).
- Speed, R. M. Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading. Chromosoma. 85, 427-437 (1982).
- Ashley, T., et al. Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates. Chromosoma. 104, 19-28 (1995).
- Baker, S. M., et al. Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13, 336-342 (1996).
- Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).
- Berkowitz, K. M., et al. Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice. PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).
- Gomez, R., et al. Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes. EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).
- Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease. Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).
- McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).
- Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites. J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Dev Biol. 169, 557-567 (1995).
