نقدم هنا، بروتوكولا لتصور الأوعية الدموية تشكيل في فيفو وفي الوقت الحقيقي في السقالات 3D بالفحص المجهري مولتيفوتون. ودرس الأوعية في السقالات المعدلة وراثيا في نموذج عيب مورين كالفاريال العظام حرجة. تم الكشف عن مزيد من الأوعية الدموية الجديدة في مجموعة العلاج من الضوابط.
إعادة بناء تشوهات العظام الحجم حاسمة لا يزال يمثل مشكلة سريرية خطيرة بسبب ضعف الأوعية داخل هندسة الأنسجة السقالات أثناء الإصلاح، مما يؤدي إلى عدم وجود إمدادات كافية من الدم ويسبب نخر الأنسجة الجديدة. الأوعية السريع شرطا حيويا لبقاء الأنسجة الجديدة والتكامل مع أنسجة المضيف القائمة. جيل دي نوفو المفرج في السقالات واحد من أهم الخطوات في جعل تجديد العظام أكثر كفاءة، مما يسمح لإصلاح الأنسجة أن تنمو لتصبح سقالة. لمعالجة هذه المشكلة، يستخدم التعديل الوراثي سقالة مادة بيولوجية للتعجيل بالأوعية وتكون العظم. ومع ذلك، تصور وتتبع في فيفو تشكيل الأوعية الدموية في الوقت الحقيقي والسقالات (3D) ثلاثي الأبعاد أو أنسجة العظام جديدة لا يزال عقبة لهندسة الأنسجة العظام. مولتيفوتون المجهري (أم) هي طريقة بيو-تصوير رواية التي يمكن الحصول على بيانات حجمية من الهياكل البيولوجية بصورة عالية الاستبانة وكسبها. وكان الهدف من هذه الدراسة لتصور الأوعية مع الفحص المجهري مولتيفوتون في فيفو في سقالة 3D-بلجا/نهاب معدلة وراثيا لإصلاح العيب كالفاريال العظام الحرجة. وقد فونكتيوناليزيد السقالات بلجا/نهاب لإيصال الجين ب pdgf عامل النمو تحمل ناقلات لينتيفيرال (LV-بدجفب) تيسيرا للأوعية وتعزيز التجدد العظام مستمرة. في العظام حرجة كالفاريال مزروع سقالة عيب طراز الماوس، مجالات الأوعية الدموية (بفاس) في السقالات بي كانت أعلى بكثير من درجة الحموضة السقالات. بالإضافة إلى ذلك، زيادة التعبير عن بدجف-ب والجينات المتعلقة بالأوعية، فوف و VEGFR2، في المقابل. تحليل ميكروكت أشارت إلى أن تكوين العظام الجديدة في مجموعة بي إتش بي تحسنت بشكل كبير بالمقارنة مع المجموعات الأخرى. على حد علمنا، هذا هو أول مرة استخدمت مجهرية مولتيفوتون في هندسة الأنسجة العظام للتحقيق في الأوعية في 3D سقالة القابلة للتحلل الأحيائي في فيفو وفي الوقت الحقيقي.
العظم هو نسيج vascularized العالية التي لا يزال تشكيلها خلال فترة حياة الفرد1. تجديد العظام السريع والفعال لتشوهات العظام الكبيرة الناجمة عن الصدمات، ونقابية، والورم ريسيكشنز، أو تشوهات الجمجمة عملية فيزيولوجية معقدة. وتشمل النهج العلاجية التقليدية المستخدمة لإصلاح عيب العظام غرس أوتوجرافت و allograft، ولكن استخدامها ينطوي على العديد من المشاكل والقيود، مثل محدودية، والاعتلال موقع كبير من المانحين، وارتفاع مخاطر العدوى، و استضافة الرفض المناعي2،3. ومع ذلك، توفر ترقيع العظام الاصطناعية بديل فعال للتخفيف من هذه القيود. أنها يمكن أن تكون مصنوعة من مواد قابلة للتحلل وسهلة لأن اختﻻق مع حجم مسام مناسبة، ويمكن أن تكون الكائنات المعدلة وراثيا4،5.
حاليا، تم توظيف السقالات هندسة الأنسجة المختلفة في تطوير هندسة الأنسجة العظام6،7. للحث على إصلاح العظام والتجديد أكثر فعالية، ظهرت الهندسة الحيوية جنبا إلى جنب مع عوامل النمو وحققت نتائج جيدة8،9. لسوء الحظ، نصف عمر قصيرة وسهلة لتفقد النشاط وجرعة سوبرافيسيولوجيكال من عوامل النمو للفعالية العلاجية الحد على التطبيق السريري10. للتغلب على هذه المشاكل، أثبت إيصال الجينات عامل النمو بدلاً من عوامل النمو كنهج فعال للحفاظ على بيواكتيفيتي لعلاج العيوب العظمى والأمراض11،12. النواقل الفيروسية إيصال واعدة أدوات لتجديد الأنسجة نتيجة عالية على التعبير عن الكفاءة13.
بين عوامل النمو، عوامل النمو المشتقة من الصفيحات (PDGF-BB) تم اختيارها في هذه الدراسة لأنها ليس فقط mitogen وتشيمواتراكتانت لخلايا mesenchymal وأوستيوجينيك، ولكن أيضا منشط للأوعية14،15 . وأظهرت الدراسات السريرية والسريرية السابقة أن PDGF-BB يمكن تعزيز إصلاح العظام في اللثة العيوب العظمى16،17بأمان وفعالية. وكشفت الدراسات التي أجريت مؤخرا أن يحفز PDGF-BB تولد الأوعية بتحفيز الخلايا غشائي الهجرة والانتشار في فيفو18،19. وعلاوة على ذلك، PDGF-BB يمكن أن تجعل أيضا الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) قادرة على التفريق في خلايا بطانية20، وهذا يسلط الضوء على مواصلة الدور المحتمل ل MSCs في نيوفاسكولاريزيشن. ولذلك، الذي يحفز تشكيل حيثياته المفرج في السقالات مع PDGF-BB خطوة هامة لإصلاح الأنسجة التي نمت في السقالات في هندسة الأنسجة العظام.
شفاء عيب العظام هو عملية morphogenetic أنسجة حيوية تتطلب منسقة تكون العظم والأوعية في مواقف إصلاح21. هو نيوانجيوجينيسيس إلى السقالات هندسة الأنسجة مزروع شرطا مسبقاً أساسيا لتزويد الخلايا بالمغذيات والأكسجين للنمو والبقاء على قيد الحياة وإزالة النفايات الأيضية. يشيع استخدام أساليب التصوير، بما في ذلك الأشعة السينية الصغرى-حسبت التصوير المقطعي (ميكروكت) والتصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي) والمسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)، والتصوير المقطعي التماسك الضوئية (OCT) والليزر [كنفوكل] الفحص المجهري، يتم تطبيق بدلاً من الفحص النسيجي للحصول على الأوعية المعلومات22،23. ومع ذلك، هذه الأساليب عقبات مختلفة في تصور وقياس نيوفاسكولاتوري في 3D السقالات في هندسة الأنسجة العظام. مولتيفوتون المجهري (أم) هو تقنية بيو-تصوير رواية نسبيا يحتوي على ميزة واضحة في نفس الوقت تصور الخلايا، المصفوفة خارج الخلية، والمحيطة بشبكات الأوعية الدموية في المجراة. أنها تمتلك قدرة تصوير ثلاثي الأبعاد الملازمة لاختراق الأنسجة العميقة ويسبب د منخفضة. أم في العقد الماضي، ومن ثم فقد اكتسب الكثير من الاهتمام في الدراسات الطبية24، بما في ذلك في علم الأعصاب، وعلم المناعة، وديناميات الخلايا الجذعية. ومع ذلك، يتم استخدامه بالكاد في أبحاث العظام.
العظم نسيج vascularized عاليا بقدرة فريدة على استمرار الشفاء وإعادة تشكيلها طوال عمر على الفردية1. مستوى الأوعية الدموية مهم لإصلاح تكون العظم وعيب. الأوعية منخفضة يحد التطبيق السريري واسعة لهندسة الأنسجة العظام. بناء العظام هندسة الأنسجة عالية vascularized وفقا لنظرية بيوميميتيقا أصب?…
The authors have nothing to disclose.
هذه الدراسة وكان يدعمها “البرنامج الطاووس شنتشن”، الصين (رقم 110811003586331)، برنامج البحوث الأساسية شنتشن (رقم JCYJ20150401150223631، رقم JCYJ20150401145529020، ورقم JCYJ20160331190714896)، قوانغدونغ العامة البحوث وبناء القدرات الخاصة البرنامج (رقم 2015A020212030)، ومؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (رقم 81501893)، وبرنامج البحوث الأساسية الوطنية الكبرى للصين (2013CB945503)، برنامج الابتكار سيت للباحثين الشباب ممتازة (Y5G010).
Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Sigma | P1941 | L/G ratio 75:25, MW 66000-107000 |
Hydroxyapatite nanoparticles | Sigma | 702153 | Average diameter < 200nm |
Chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
FITC-conjugated 250-kD dextran | Sigma | FD250S | |
1,4-dioxane | lingfeng,Shanghai | 0.45 micron | |
Stericup filters | Merck Millipore Corporation | SLHV033RB | |
PDGF-BB Cdna | Sino Biological, Inc | MZ50801-G | |
Anti-PDGF-BB mouse polyclonal antibody | BioVision, Inc | 5489-30T | |
PDGF-BB recombinant protein | 4489-50 | ||
Calcium-phosphate transfection solution | Promega Corporation | E1200 | |
L-DMEM | Hyclone | SH30021.01 | |
DPBS | Hyclone | SH30028.01 | |
Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
FBS | Thermo Fisher Scientific | 10099-141 | |
Transwell | Corning | 3422 | |
Male BALB/c mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | ||
sodium pentobarbital | Merck | 1063180500 | |
multiphoton microscopy | A homemade in Shenzhen Institutes of Advanced Technology to detect two-photon excited fluorescence (TPEF) and second harmonic generation signal (SHG). | ||
isoflurane | Keyuan, Shandong | 401750169 | |
TRIzol reagent | Invitrogen | 15596018 | |
PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara | RR420B | |
SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR036B | |
Hematoxylin and eosin | Beyotime | C0105 | |
Paraffin | Leica | RM2235 | |
Ultracentrifuge OPtima L-100XP | Beckman Coulter | L-100XP | |
Low-temperature printer | Tsinghua university | A homemade in Tsinghua university | |
LightCycler 480 instrument | Roche | 5815916001 | |
microCT | Bruker | 1176 | |
commercial software | Bruker |