Visualiseren van angiogenese door Multiphoton microscopie In Vivo in genetisch gemodificeerde 3D-PLGA/nHAp steiger voor Calvarial kritische bot Defect reparatie
Summary
Hier presenteren we een protocol om te visualiseren bloedvat vorming in vivo en in real-time in 3D steigers door multiphoton microscopie. Angiogenese in genetisch gemodificeerde steigers werd bestudeerd in een lymfkliertest calvarial kritische bot defect model. Meer nieuwe bloedvaten werden ontdekt in de behandelde groep dan in besturingselementen.
Abstract
De wederopbouw van kritisch formaat bot gebreken blijft een ernstig klinisch probleem vanwege slechte angiogenese binnen weefsel-engineered steigers tijdens reparatie, die leidt tot een gebrek aan voldoende bloedtoevoer en veroorzaakt necrose van de nieuwe weefsels. Snelle vascularisatie is een essentiële voorwaarde voor nieuwe weefsel overleving en integratie met bestaande weefsel van de gastheer. De DOVO generatie therapieën in de steigers is een van de belangrijkste stappen in het maken van bot regeneratie efficiënter, waardoor herstel van weefsel te groeien tot een steiger. Om dit probleem aan te pakken, wordt de genetische modificatie van een steiger biomaterial gebruikt voor het versnellen van de angiogenese en osteogenesis. Visualiseren en bijhouden in vivo is bloedvat vorming in real time en in driedimensionale (3D) steigers of nieuwe botweefsel echter nog steeds een belemmering voor weefselengineering van bot. Multiphoton microscopie (MPM) is een roman bio-imaging modaliteit die volumetrische gegevens uit biologische structuren in een hoge resolutie en minimaal-invasieve manier verwerven kan. Het doel van deze studie was om te visualiseren angiogenese met multiphoton microscopie in vivo in een genetisch gemodificeerde 3D-PLGA/nHAp steiger voor calvarial kritische bot defect reparatie. PLGA/nHAp steigers werden matiemaatschappij voor de duurzame levering van een groeifactor pdgf-b gen uitvoering van lentivirale vectoren (LV –pdgfb), ter vergemakkelijking van de angiogenese en ter verbetering van de regeneratie van bot. In een scaffold-geïmplanteerd calvarial kritische bot defect muismodel, de bloedvat gebieden (BVAs) in PHp steigers waren aanzienlijk hoger dan in de steigers van de PH. Bovendien, verhoogd de uitdrukking van de pdgf-b en angiogenese-gerelateerde genen, vWF en VEGFR2, dienovereenkomstig. MicroCT analyse aangegeven dat de nieuwe biomineralisatie in de PHp groep drastisch verbeterd in vergelijking met de andere fracties. Om onze kennis is dit de eerste keer multiphoton microscopie werd gebruikt in bot-weefselengineering te onderzoeken van de angiogenese in een 3D bio-afbreekbaar steiger in vivo en in real-time.
Introduction
Bot is een zeer gevacuoliseerd weefsel dat blijft gedurende de looptijd van een individuele1remodelleren. De snelle en effectieve bot regeneratie van groot bot gebreken als gevolg van trauma, nonunion, resections van de tumor, of craniofaciale misvormingen is een complex fysiologische proces. Traditionele therapeutische benaderingen gebruikt voor bot defect reparatie omvatten autograft en allograft implantatie, maar hun gebruik gepaard gaat met meerdere problemen en beperkingen, zoals beperkte beschikbaarheid, belangrijke donor site morbiditeit, een hoog risico van infectie, en host immuun afwijzing2,3. Kunstmatige Bottransplantaten bieden echter een efficiënt alternatief voor het verlichten van deze beperkingen. Ze kunnen worden gemaakt van biologisch afbreekbare materialen, zijn eenvoudig te fabriceren worden met een geschikt poriegrootte en kunnen genetisch gemodificeerde4,5.
Op dit moment zijn verschillende weefsel engineering steigers tewerkgesteld in de ontwikkeling van de bot weefsel-engineered6,7. Om bot reparatie en regeneratie effectiever, hebben gemanipuleerde biomaterialen gecombineerd met groeifactoren ontstaan en bereikt goede resultaten8,9. Helaas, de korte halfwaardetijd, gemakkelijk-aan-lose activiteit en supraphysiological dosering van groeifactoren voor therapeutische werkzaamheid beperken hun klinische toepassing10. Om deze problemen, is de levering van groeifactor genen in plaats van groeifactoren aangetoond als een effectieve aanpak te handhaven topicale voor de behandeling van ossaal gebreken en ziekten11,12. Virale vectoren zijn veelbelovende levering hulpmiddelen voor weefselregeneratie vanwege hun hoge efficiëntie13uitdrukken.
Onder de groeifactoren, werd bloedplaatjes afkomstige groei factor (PDGF-BB) geselecteerd in deze studie want het is niet alleen een mitogeen en chemoattractant voor mesenchymale en osteogenic cellen, maar ook een stimulans voor angiogenese14,15 . Vorige preklinische en klinische studies toonden aan dat PDGF-BB veilig en effectief bot reparatie van parodontale werden gebreken16,17 bevorderen kan. Recente studies is gebleken dat PDGF-BB angiogenese door motiverende endothelial cel migratie en proliferatie in vivo18,19 stimuleert. Bovendien, PDGF-BB kunt ook renderen mesenchymale stamcellen (MSCs) geschikt voor differentiatie in de endotheliale cellen20, en deze verdere hoogtepunten van de potentiële rol van MSCs in neovascularization. De vorming van DOVO van therapieën in steigers met PDGF-BB inducerende is daarom een belangrijke stap voor de reparatie van weefsel uitgegroeid tot steigers in bot weefselengineering.
Bot defect genezing is een dynamische weefsel morfogenetische proces dat gecoördineerde osteogenesis en angiogenese aan de reparatie posities21 vereist. Neoangiogenesis in de geïmplanteerde weefsels-engineered steigers is een essentiële voorwaarde voor het verstrekken van cellen met voedingsstoffen en zuurstof voor groei en overleving en metabolische afvalstoffen verwijderen. Veelgebruikte methoden imaging, berekend met inbegrip van X-ray micro-tomografie (microCT), magnetische resonantie beeldvorming (MRI), scanning elektronen microscopie (SEM), optische coherentie tomografie (OCT) en confocale laser scanning microscopie, worden toegepast in plaats van histopathologisch onderzoek te verkrijgen van de angiogenese informatie22,23. Deze methoden worden echter verschillende obstakels in het visualiseren en het meten van neovasculature in 3D steigers in bot weefselengineering geconfronteerd. Multiphoton microscopie (MPM) is een relatief nieuwe bio-imaging techniek, die het duidelijke voordeel heeft van gelijktijdig visualiseren van cellen, extracellulaire matrix, en vasculaire netwerken rond in vivo. Het bezit van een inherente driedimensionale beeldvorming capaciteit voor diepe weefsel penetratie en lage photodamage veroorzaakt. Vandaar, in het laatste decennium, MPM heeft opgedaan veel aandacht in biomedische studies24, met inbegrip van in de neurowetenschappen, immunologie en dynamiek van de cel van de stam. Het wordt echter nauwelijks gebruikt in orthopedisch onderzoek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bot is een zeer gevacuoliseerd weefsel met een unieke capaciteit om voortdurend te genezen en remodelleren gedurende de levensduur van een individuele1. Het niveau van de vascularisatie is belangrijk voor osteogenesis en defect reparatie. Lage vascularisatie beperkt de brede klinische toepassing van weefsel-engineered bot. Bouw van een zeer gevacuoliseerd weefsel-engineered bone volgens de theorie van biomimetics is een hulpprogramma voor het repareren van grote segment bot gebreken geworden. Vers…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door het Shenzhen Peacock programma, China (nr. 110811003586331), de Shenzhen Basic Research Program (nr. JCYJ20150401150223631, nr. JCYJ20150401145529020 en nr. JCYJ20160331190714896), het Guangdong openbaar onderzoek en capaciteitsopbouw Special Program (nr. 2015A020212030), de nationale natuurlijke Science Foundation van China (nr. 81501893), de nationale Major Basic Research Program van China (2013CB945503), en de SIAT innovatie programma voor uitstekende jonge onderzoekers (Y5G010).
Materials
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Sigma | P1941 | L/G ratio 75:25, MW 66000-107000 |
| Hydroxyapatite nanoparticles | Sigma | 702153 | Average diameter < 200nm |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| FITC-conjugated 250-kD dextran | Sigma | FD250S | |
| 1,4-dioxane | lingfeng,Shanghai | 0.45 micron | |
| Stericup filters | Merck Millipore Corporation | SLHV033RB | |
| PDGF-BB Cdna | Sino Biological, Inc | MZ50801-G | |
| Anti-PDGF-BB mouse polyclonal antibody | BioVision, Inc | 5489-30T | |
| PDGF-BB recombinant protein | 4489-50 | ||
| Calcium-phosphate transfection solution | Promega Corporation | E1200 | |
| L-DMEM | Hyclone | SH30021.01 | |
| DPBS | Hyclone | SH30028.01 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10099-141 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| Male BALB/c mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | ||
| sodium pentobarbital | Merck | 1063180500 | |
| multiphoton microscopy | A homemade in Shenzhen Institutes of Advanced Technology to detect two-photon excited fluorescence (TPEF) and second harmonic generation signal (SHG). | ||
| isoflurane | Keyuan, Shandong | 401750169 | |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara | RR420B | |
| SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR036B | |
| Hematoxylin and eosin | Beyotime | C0105 | |
| Paraffin | Leica | RM2235 | |
| Ultracentrifuge OPtima L-100XP | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Low-temperature printer | Tsinghua university | A homemade in Tsinghua university | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5815916001 | |
| microCT | Bruker | 1176 | |
| commercial software | Bruker |
References
- Hu, X., et al. GPNMB enhances bone regeneration by promoting angiogenesis and osteogenesis: potential role for tissue engineering bone. J Cell Biochem. 114 (12), 2729-2737 (2013).
- Schroeder, J. E., Mosheiff, R. Tissue engineering approaches for bone repair: concepts and evidence. Injury. 42 (6), 609-613 (2011).
- Chiarello, E., et al. allograft and bone substitutes in reconstructive orthopedic surgery. Aging Clin Exp Res. 25, S101-S103 (2013).
- Elangovan, S., et al. The enhancement of bone regeneration by gene activated matrix encoding for platelet derived growth factor. Biomaterials. 35 (2), 737-747 (2014).
- Bouyer, M., et al. Surface delivery of tunable doses of BMP-2 from an adaptable polymeric scaffold induces volumetric bone regeneration. Biomaterials. 104, 168-181 (2016).
- Rezwan, K., et al. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
- Burg, K. J., Porter, S., Kellam, J. F. Biomaterial developments for bone tissue engineering. Biomaterials. 21 (23), 2347-2359 (2000).
- Xiao, Y., et al. Modifications of collagen-based biomaterials with immobilized growth factors or peptides. Methods. 84, 44-52 (2015).
- Chen, G., Lv, Y. Immobilization and Application of Electrospun Nanofiber Scaffold-based Growth Factor in Bone Tissue Engineering. Curr Pharm Des. 21 (15), 1967-1978 (2015).
- Kofron, M. D., Li, X., Laurencin, C. T. Protein- and gene-based tissue engineering in bone repair. Curr Opin Biotechnol. 15 (5), 399-405 (2004).
- Chen, F. M., et al. New insights into and novel applications of release technology for periodontal reconstructive therapies. J Control Release. 149 (2), 92-110 (2011).
- Winn, S. R., et al. Gene therapy approaches for modulating bone regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 42 (1-2), 121-138 (2000).
- Chang, P. C., et al. Adenovirus Encoding Human Platelet-Derived Growth Factor-B Delivered to Alveolar Bone Defects Exhibits Safety and Biodistribution Profiles Favorable for Clinical Use. Hum Gene Ther. 20 (5), 486-496 (2009).
- Phipps, M. C., Xu, Y. Y., Bellis, S. L. Delivery of Platelet-Derived Growth Factor as a Chemotactic Factor for Mesenchymal Stem Cells by Bone-Mimetic Electrospun Scaffolds. Plos One. 7 (7), (2012).
- Gehmert, S., et al. Angiogenesis: The role of PDGF-BB on Adiopse-tissue derived Stem Cells (ASCs). Clin Hemorheol and Microcirc. 48 (1-3), 5-13 (2011).
- Chang, P. C., et al. PDGF-B gene therapy accelerates bone engineering and oral implant osseointegration. Gene Ther. 17 (1), 95-104 (2010).
- Javed, F., et al. Significance of the platelet-derived growth factor in periodontal tissue regeneration. Arch Oral Biol. 56 (12), 1476-1484 (2011).
- Murali, R., et al. Biomimetic hybrid porous scaffolds immobilized with platelet derived growth factor-BB promote cellularization and vascularization in tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 104 (2), 388-396 (2016).
- Andrae, J., Gallini, R., Betsholtz, C. Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine. Genes Dev. 22 (10), 1276-1312 (2008).
- Wosnitza, M., et al. Plasticity of human adipose stem cells to perform adipogenic and endothelial differentiation. Differentiation. 75 (1), 12-23 (2007).
- Hankenson, K. D., et al. Angiogenesis in bone regeneration. Injury. 42 (6), 556-561 (2011).
- Schmidt, C., et al. Rapid three-dimensional quantification of VEGF-induced scaffold neovascularisation by microcomputed tomography. Biomaterials. 30 (30), 5959-5968 (2009).
- Perng, C. K., et al. In Vivo Angiogenesis Effect of Porous Collagen Scaffold with Hyaluronic Acid Oligosaccharides. J Surg Res. 168 (1), 9-15 (2011).
- Sun, Y., et al. Imaging tissue engineering scaffolds using multiphoton microscopy. Microsc Res Tech. 71 (2), 140-145 (2008).
- Fan, X., et al. Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging. PLoS One. 6 (1), e16348 (2011).
- Yeo, M. G., Kim, G. H. Preparation and Characterization of 3D Composite Scaffolds Based on Rapid-Prototyped PCL/β-TCP Struts and Electrospun PCL Coated with Collagen and HA for Bone Regeneration. Chem Mater. 24 (5), 903-913 (2012).
- Mao, Y., et al. Lentiviral Vectors Mediate Long-Term and High Efficiency Transgene Expression in HEK 293T cells. Int J Med Sci. 12 (5), 407-415 (2015).
- Li, J., et al. Investigation of angiogenesis in bioactive 3-dimensional poly (D,L-lactide-co-glycolide)/nano-hydroxyapatite scaffolds by in vivo multiphoton microscopy in murine calvarial critical bone defect. Acta Biomater. 42, 389-399 (2016).
- Abbasi, H., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of goat undifferentiated spermatogonia. Anim Reprod Sci. 163, 10-17 (2015).
- Pigossi, S. C., et al. Bacterial cellulose-hydroxyapatite composites with osteogenic growth peptide (OGP) or pentapeptide OGP on bone regeneration in critical-size calvarial defect model. J Biomed Mater Res A. , (2015).
- Bos, G. D., et al. The effect of histocompatibility matching on canine frozen bone allografts. J Bone Joint Surg Am. 65 (1), 89-96 (1983).
- Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials. J Craniofac Surg. 1 (1), 60-68 (1990).
- Hollanders, K., et al. Bevacizumab Revisited: Its Use in Different Mouse Models of Ocular Pathologies. Curr Eye Res. 40 (6), 611-621 (2015).
- Gao, L. QSIM: quantitative structured illumination microscopy image processing in ImageJ. Biomed Eng Online. 14, 4 (2015).
- Kobat, D., et al. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Opt Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
- Lohmann, P., et al. Bone regeneration induced by a 3D architectured hydrogel in a rat critical-size calvarial defect. Biomaterials. 113, 158-169 (2016).
- Lv, J., et al. Enhanced angiogenesis and osteogenesis in critical bone defects by the controlled release of BMP-2 and VEGF: implantation of electron beam melting-fabricated porous Ti6Al4V scaffolds incorporating growth factor-doped fibrin glue. Biomed Mater. 10 (3), (2015).
- Guldberg, R. E., et al. 3D imaging of tissue integration with porous biomaterials. Biomaterials. 29 (28), 3757-3761 (2008).
- Boehler, R. M., et al. A PLG/HAp composite scaffold for lentivirus delivery. Biomaterials. 34 (21), 5431-5438 (2013).
- Heo, S. J., et al. Fabrication and characterization of novel nano- and micro-HA/PCL composite scaffolds using a modified rapid prototyping process. J Biomed Mater Res A. 89 (1), 108-116 (2009).
