דגירה ממושכת של רקמות חריפות עצביות עבור Electrophysiology ו-הדמית סידן
Summary
הוסר לאחר מהגוף, רקמה עצבית היא השפיעה מאוד על ידי תנאים סביבתיים, המוביל השפלה הסופי של רקמות לאחר 6 – 8 שעות. באמצעות שיטת דגירה ייחודית, אשר מקיימים מעקב קפדני אחרת ומסדירה את הסביבה התאית של הרקמות, כדאיויות רקמות ניתן להאריך באופן משמעותי עבור> 24 שעות.
Abstract
חריפת הכנות רקמות עצביות, פרוסות מוח wholemount רשתית, בדרך כלל יכול להישמר רק 6 – 8 שעות לאחר ניתוח. עובדה זו מגבילה את זמן הניסוי, ומגדיל את מספר בעלי החיים בהם נעשה שימוש לכל מחקר. מגבלה זו משפיעה באופן ספציפי פרוטוקולים כגון הדמית סידן הדורשים דגירה מראש ממושך עם צבעים להחיל אמבטיה. גידול מעריכי חיידקים תוך 3 – 4 שעות לאחר החיתוך מתואם היטב עם ירידת בריאות רקמות. מחקר זה מתאר שיטה להגביל את ההתפשטות של חיידקים בהכנות חריפות לשמור רקמות עצביות קיימא עבור פרק הזמן ממושך (> 24 ח) ללא הצורך באנטיביוטיקה, נהלים סטרילית, או תקשורת ותרבות רקמה המכילה גורמי גדילה. ידי רכיבה על אופני נוזל החוץ-התאים באמצעות קרינת UV ו לשמור על שלמות הרקמה בתא חזק מותאם אישית ב 15 – 16 מעלות צלזיוס, הרקמה מראה שום הבדל תכונות אלקטרו, או סי סידןgnaling באמצעות צבעים סידן תאיים ב> 24 שעות postdissection. שיטות אלה לא רק להרחיב את זמן הניסוי עבור אלה באמצעות רקמה עצבית חריפה, אך תפחית את מספר בעלי החיים הנדרשים כדי להשלים מטרות הניסוי, ותציב סטנדרט הזהב הדגירה רקמה עצבית חריפה.
Introduction
Electrophysiology והדמיה תפקודית (סידן, מתח צבעים רגישים) הם שתיים ניסיונותיי בטכניקות הנפוצות ביותר במדעי המוח. מוח הכנות פרוסות wholemount ברשתית, אשר תיבחן כאן, לספק אמצעי לבחון תכונות אלקטרו וקישוריות הסינפטי ללא זיהום הרדמה או מרפי שרירים. פרוסות רשתית המוח wholemount לשמור על שלמות מבנית שלהם, בניגוד תרבויות או homogenates התא, וכך מתאפשר לחקר מעגלים ספציפיים ורשתות המוח 1. הקלטות מרקמות מבודדות יש יתרונות על פני הקלטות vivo כתנועות הקשורים פעילות הלב והנשימה בוטלו. יתר על כן, להדמיה ישירה מאפשרת שיעורים ספציפיים של תאים להיות ממוקד, יישום מקומי של כלי התרופתי 2, 3.
הקלטות תיקון מהדק ו Calcium צבען טעינת wholemount רשתית הוא מסובך בשל הקיום של Inner הגבלת ממברנה (ILM), אשר מכסה את תא גנגליון רשתית (RGC) השכבה ומונעת גישה ישירה אל התאים. בדרך כלל, קרום זה שגירד עם טפטפת זכוכית כדי לאפשר יישום ישיר של תיקון פיפטה היווצרות חותם gigaohm על תא בודד. בנוסף, צבעי סידן מיושם אמבטיה לא לחצות את ILM ואו חייב להיות מוזרק מתחת קרום זה 4, retrogradely מועברים ההזרקה הבאה עצב הראייה 5 או electroporated דרך הרקמה 6. יתר על כן, כאשר ניצול מודל מכרסם של רטיניטיס פיגמנטוזה, עכבר rd / rd, את ILM הוא עבה יותר חדיר. כאן, אנו משתמשים בטכניקה כדי להסיר את ILM עם עיכול אנזימטי 7, כדי לאפשר הן סידן נמצא בכל מקום טעינת צבע, וגישה ישירה לתאי הגנגליון ברשתית עבור recordi תיקון- clampNGS 8.
הקלטות מוצלחות מ פרוס או מוח או wholemount רשתית תלויות לנתיחת דגירה של רקמה עצבית קיימא. בדרך כלל, רקמה מופקת בבוקרו של הניסוי וטופחה בנוזל מלאכותי השדרתי (aCSF) עד שהוא משמש להקלטות. בדרך כלל, רקמה נשארת קיימא עבור 6 – 8 שעות, עם השפלה משמעותית הבאים חלון זמן זה. עם זאת, הן פרוסות המוח והכנות רשתיות wholemount בדרך כלל לייצר יותר רקמות מאשר ניתן להקליט בתוך פרק זמן קצר זה. כתוצאה מכך, רקמה נמחקת לעתים קרובות בסוף היום לנתיחה תושלם שוב בימים שלאחר מכן. משמעות דבר היא חיה אחרת מנוצלת ו ~ 2 שעות של התקנה לנתיחה / מכתים חזר. הפרוטוקול הבא מתאר שיטה עבור הארכת החיים של רקמות עצביות במשך יותר מ -24 שעות, כלומר פחות בעלי חיים מנוצלים, ועוד זמן ניסוי זמין. הכדאיות רקמות wכפי שהוערך באמצעות רישום תכונות אלקטרו ודינמיקה סידן, ומאפיינים אלה אי אפשר היה להבחין בין <ג 4 ו> 24 שעות postdissection.
תוצאות אלו מצביעות כי לא רק הם המאפיינים תא בודד ללא פגע ופונקציונלי לאחר דגירה ממושכת, אך פעילות הרשת, כפי שהוערך על ידי סידן הדמיה הקלטות אלקטרו, הוא ללא שינוי> 24 שעות postdissection. יתר על כן, אנו מראים כי צבעי סידן יכולים להישאר בתאים לתקופות ממושכות מבלי לגרום השפעות מזיקות. יישום של פרוטוקול זה מוכיח כי הפעילות התפקודית של נוירונים ברקמה עצבית חריפה יכולה להישמר במשך תקופות ארוכות, פעם הסביבה החיצונית היא פיקוח הדוק. יתר על כן, כפי כדאיויות רקמות משתנות במידה רבה בין מעבדות עקב פרוטוקולי דגירה שונים, שיטה זו קובעת סטנדרט זהב הפרמטרים האידיאליים כי יש להחיל להפחית השתנות בבריאות neu החריפהרקמת רונאל.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר שיטת דגירה להאריך את הכדאיות של רקמות עצביות חריפות לניסויי הדמית אלקטרו, ובכך להפחית את מספרי החיה הדרושים כדי להשלים מטרות ניסוי. שני תהליכים עיקריים הקובעים את ההידרדרות של רקמה עצבית לאורך זמן: i) רמות חיידקים מוגברים, וגידול ליווי רעלן פנימי חיידקים …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Colin Symons and James Wright for technical assistance. This work was supported by seed funding grant (WSU) to Y.B. and the innovation office at Western Sydney University. M.C. is supported by ARC fellowship (DECRA).
Materials
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich VETEC | V800372 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | |
| N-Methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S2554 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | 223506 | |
| Papain Dissociation System | Worthington | LK003150 | |
| Dimethyl sulfoxide anhydrous | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Pluronic F-127 Low UV absorbance* | Life technologies | P-6867 | 20% solution in DMSO |
| Fura-2 AM | Anaspec | 84017 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F23917 | |
| Fluo-8 AM | Abcam | Ab142773 | |
| Vibrating blade microtome | Leica Biosystem | VT1200 S | Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device |
| Antivibration table | Kinetic Systems Vibraplane | Vibraplane 9100/9200 | |
| Fixed Stage Upright Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Microscope Objective | Olympus | XLUMPlanFLN 20x/1.00w | 20X |
| Microscope Objective | Olympus | LUMPlanFLN 60x/1.00w | 60X |
| CCD Camera | Andor | Ixon + | |
| High speed wavelength switcher | Sutter instrument | Lambda DG-4 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instrument Co | BF150-86-10 | |
| Microelectrode puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-40LP | Low Profile Open Bath Chambers |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
| Andor iQ Live Cell Imaging Software | Andor | Andor iQ3 | |
| Braincubator | Payo Scientific | BR26021976 | www.braincubator.com.au |
| Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler | TE Technology | CP-121 | |
| Temperature Controller | TE Technology | TC-36-25 RS232 |
References
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Meth mol biol. 337, 117-125 (2006).
- Gibb, A., Edwards, F. Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelect Techniq. , 255-274 (1994).
- Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3. Photochem photobiol sci. 11 (3), 508-513 (2012).
- Blankenship, A. G., et al. Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves. Neuron. 62 (2), 230-241 (2009).
- Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Perez De Sevilla Muller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J Vis Exp. (92), e51396 (2014).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina. J Vis Exp. (99), e52588 (2015).
- Velte, T. J., Masland, R. H. Action potentials in the dendrites of retinal ganglion cells. J neurophysiol. 81 (3), 1412-1417 (1999).
- Cameron, M., et al. Calcium imaging of AM dyes following prolonged incubation in acute neuronal tissue. PLoS ONE. 11 (5), (2016).
- Buskila, Y., Morley, J. W., Tapson, J., van Schaik, A. The adaptation of spike backpropagation delays in cortical neurons. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Breen, P. P., Buskila, Y. Braincubator: An incubation system to extend brain slice lifespan for use in neurophysiology. Eng Med Biol Soc. , 4864-4867 (2014).
- Buskila, Y., Breen, P., Wright, J. Device for storing a tissue sample. WIPO Patent. , (2015).
- Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Sci Rep. 4, 4-10 (2014).
- Buskila, Y., Farkash, S., Hershfinkel, M., Amitai, Y. Rapid and reactive nitric oxide production by astrocytes in mouse neocortical slices. Glia. 52 (3), 169-176 (2005).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).
- Buskila, Y., et al. Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse. PLoS ONE. 2 (9), 9 (2007).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
