Method Article

דגירה ממושכת של רקמות חריפות עצביות עבור Electrophysiology ו-הדמית סידן

DOI:

10.3791/55396

⸱

February 15th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The MARCS Institute, Western Sydney University, 2School of Medicine, Western Sydney University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הוסר לאחר מהגוף, רקמה עצבית היא השפיעה מאוד על ידי תנאים סביבתיים, המוביל השפלה הסופי של רקמות לאחר 6 - 8 שעות. באמצעות שיטת דגירה ייחודית, אשר מקיימים מעקב קפדני אחרת ומסדירה את הסביבה התאית של הרקמות, כדאיויות רקמות ניתן להאריך באופן משמעותי עבור> 24 שעות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חריפת הכנות רקמות עצביות, פרוסות מוח wholemount רשתית, בדרך כלל יכול להישמר רק 6 - 8 שעות לאחר ניתוח. עובדה זו מגבילה את זמן הניסוי, ומגדיל את מספר בעלי החיים בהם נעשה שימוש לכל מחקר. מגבלה זו משפיעה באופן ספציפי פרוטוקולים כגון הדמית סידן הדורשים דגירה מראש ממושך עם צבעים להחיל אמבטיה. גידול מעריכי חיידקים תוך 3 - 4 שעות לאחר החיתוך מתואם היטב עם ירידת בריאות רקמות. מחקר זה מתאר שיטה להגביל את ההתפשטות של חיידקים בהכנות חריפות לשמור רקמות עצביות קיימא עבור פרק הזמן ממושך (> 24 ח) ללא הצורך באנטיביוטיקה, נהלים סטרילית, או תקשורת ותרבות רקמה המכילה גורמי גדילה. ידי רכיבה על אופני נוזל החוץ-התאים באמצעות קרינת UV ו לשמור על שלמות הרקמה בתא חזק מותאם אישית ב 15 - 16 מעלות צלזיוס, הרקמה מראה שום הבדל תכונות אלקטרו, או סי סידןgnaling באמצעות צבעים סידן תאיים ב> 24 שעות postdissection. שיטות אלה לא רק להרחיב את זמן הניסוי עבור אלה באמצעות רקמה עצבית חריפה, אך תפחית את מספר בעלי החיים הנדרשים כדי להשלים מטרות הניסוי, ותציב סטנדרט הזהב הדגירה רקמה עצבית חריפה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Electrophysiology והדמיה תפקודית (סידן, מתח צבעים רגישים) הם שתיים ניסיונותיי בטכניקות הנפוצות ביותר במדעי המוח. מוח הכנות פרוסות wholemount ברשתית, אשר תיבחן כאן, לספק אמצעי לבחון תכונות אלקטרו וקישוריות הסינפטי ללא זיהום הרדמה או מרפי שרירים. פרוסות רשתית המוח wholemount לשמור על שלמות מבנית שלהם, בניגוד תרבויות או homogenates התא, וכך מתאפשר לחקר מעגלים ספציפיים ורשתות המוח 1. הקלטות מרקמות מבודדות יש יתרונות על פני הקלטות vivo כתנועות הקשורים פעילות הלב והנשימה בוטלו. יתר על כן, להדמיה ישירה מאפשרת שיעורים ספציפיים של תאים להיות ממוקד, יישום מקומי של כלי התרופתי 2,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול להלן מתאר את הכנת C57BL / 6 ו C3H / הוא (retinally מנוונת) עכבר רקמות עצביות, אך בטכניקות דומות ניתן ליישם מינים אחרים. כל בעלי החיים היו בריאים מטופלים עם תנאים סטנדרטיים של טמפרטורה, לחות, 12 שעות אור / חושך מחזור, גישה חופשית למזון ומים, וללא גירויי מתח מיועדים. כל הניסויים אושרו ובוצעו בהתאם טיפול בבעלי חיים באוניברסיטת מערב סידני ואתיקה הוועדה ועל פי השימוש בבעלי חיים והנחיות טיפול (A9452 # רשות המחקר בבעלי חיים, # A10396 ו A8967 #).

1. הכנת פרוסת המוח

  1. להרדים את החיה על ידי שא....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רגולציה הדוקה של העומס חום חיידקים של aCSF במהלך הדגירה היא חיונית כדי לשמור על כדאיות רקמות עצבית. זה יכול להיות מותאם באמצעות הקרנת אור UVC ושמירה על הטמפרטורה של aCSF ב 15 - 16 ° C (איור 1). יתר על כן, aCSF פרמטרים החותם (APS; איור 1 ג) מספק הנסיין עם רקורד של התנאים הסביבתיים (pH ואת זמנים.), ובכך להציע סטנדרט זהב פרמטרים כאשר דוגר רקמה עצבית, אשר, אם בעקבותיו, תפחית השתנות בין ניסויים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר שיטת דגירה להאריך את הכדאיות של רקמות עצביות חריפות לניסויי הדמית אלקטרו, ובכך להפחית את מספרי החיה הדרושים כדי להשלים מטרות ניסוי. שני תהליכים עיקריים הקובעים את ההידרדרות של רקמה עצבית לאורך זמן: i) רמות חיידקים מוגברים, וגידול ליווי רעלן פנימי חיידקים שוחרר, ii) יתר רעיל אשר עוקב אחר הליך החיתוך הטראומתי 10. כמו רקמה עצבית חריפה היא הגנה על איכות הסביבה, רגולציה הדוקה של הסביבה רקמות באמצעות מעקב צמוד של pH, טמפרטורה ורמת חיידקים חיונית לשמי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יוסי בוסקילה ופול ברין מצהירים כי הם בעלים משותפים של PAYO Scientific Pty Ltd, חברה המתמחה בבניית מערכות דגירה לרקמות עצביות חריפה. כל המחברים האחרים אינם מדווחים על אינטרסים פיננסיים או ניגודי אינטרסים פוטנציאליים הקשורים למחקר הנוכחי.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לקולין סימונס וג'יימס רייט על הסיוע הטכני. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מימון ראשוני (WSU) ל-Y.B. ולמשרד החדשנות באוניברסיטת מערב סידני. M.C. נתמך על ידי מלגת ARC (DECRA).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
נתרן כלוריסיגמא אולדריץ' VETECV800372
אשלגן כלוריסיגמא אולדריץ'P9333
N-מתיל-D-גלוקמיןסיגמא אולדריץ'M2004 
D-גלוקוזסיגמא אולדריץ'G5767
נתרן ביקרבונטסיגמא אולדריץ'S6014
נתרן פוספט מונו-בסיסיסיגמא אולדריץ'S2554
מגנזיום כלורידסיגמא אולדריץ'M9272 
סידן כלורי סיגמא אולדריץ'223506
מערכת דיסוציאציה פפאיןוורת'ינגטון 
דימתיל סולפוקסיד נטול מיםסיגמא אולדריץ'276855
פלורוניק F-127 ספיגת UV נמוכה*טכנולוגיות חייםP-6867תמיסה 20% ב-DMSO 
פורה-2 AM   Anaspec84017
Fluo-4 AM   Life TechnologiesF23917
Fluo-8 AMAbcamAb142773
מיקרוטום להב רוטט Leica BiosystemVT1200 Sמצויד ב- Leica ' s Vibrocheck ™ מכשיר מדידה 
שולחן אנטי רטטמערכות קינטיות ויברפלין ויברפליין 9100/9200 
שלב קבוע מיקרוסקופ זקוףאולימפוסBX51WI 
מיקרוסקופ אובייקטיביאולימפוסXLUMPlanFLN 20x/1.00w20X 
מיקרוסקופ אובייקטיביאולימפוסLUMPlanFLN 60x/1.00w60X
CCD מצלמהאנדוראיקסון +
מחליף אורך גל במהירות גבוההמכשיר סאטרLambda DG-4 
מגבר מהדק תיקוןהתקנים מולקולרייםMultiClamp 700B
מערכת רכישת נתוניםהתקנים מולקולרייםDigidata 1440AAxon Digidata® מערכת
נימי זכוכית בורוסיליקטSutter Instrument CoBF150-86-10
חולץ מיקרואלקטרודותSutter Instrument CoP-97חולץ מיקרופיפטה מסוג בוער / חום
הקלטה / זלוףWarner InstrumentsRC-40LPפרופיל נמוך תאי אמבטיה פתוחים
תוכנההתקנים מולקולרייםpClamp 10.2
Andor iQ Live Cell ImagingSoftware AndoriQ3
BraincubatorPayo ScientificBR26021976www.braincubator.com.au
Peltier-Thermoelectric Cold Plate CoolerTE TechnologyCP-121
בקר טמפרטורהTE TechnologyTC-36-25 RS232
LK003150 תא

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Meth mol biol. 337, Clifton, N.J. 117-125 (2006).
  2. Gibb, A., Edwards, F. Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelect Techniq. , 255-274 (1994).
  3. Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Acute Neuronal TissueBrain Slice PreparationRetinal WholemountProlonged Tissue IncubationUV Irradiation MethodCalcium Imaging ProtocolElectrophysiology RecordingBraincubator SystemCarbogen OxygenationTemperature Control

Related Articles