Die Verwendung eines β-Lactamase-basierte Conductimetric Biosensor-Assays, biomolekulare Wechselwirkungen zu erkennen
Summary
Dabei berichten wir über eine neue Methode, um Protein-Protein-Interaktionen mit Hilfe eines conductimetric Biosensors basierend auf die β-Lactamase-Hybridtechnologie zu studieren. Diese Methode beruht auf der Freisetzung von Protonen bei der Hydrolyse des β–Lactame.
Abstract
Biosensoren werden immer wichtiger und implementierte in verschiedenen Bereichen wie Erregernachweis, molekulare Diagnostik, Umweltüberwachung und Kontrolle der Lebensmittelsicherheit. In diesem Zusammenhang wird β-Lactamases als effiziente Reporter Enzyme in mehreren Studien der Protein-Protein-Interaktion verwendet. Darüber hinaus fördert ihre Fähigkeit, Einfügungen von Peptiden oder strukturierte Proteine/Domains stark anzunehmen die Nutzung dieser Enzyme um Chimären Proteinen zu erzeugen. In einer aktuellen Studie einer einzelnen Domäne Antikörper-Fragment in der Bacillus Licheniformis BlaP β-Lactamase eingelegt werden. Diese kleinen Domänen, auch genannt Nanobodies, gelten als Antigen-bindenden Domänen einzelne Kette Antikörper von Camelids. Wie üblich Doppelkette Antikörper zeigen sie hohen Affinitäten und Besonderheiten für ihre Ziele. Das daraus resultierende Chimäre Protein ausgestellt eine hohe Affinität gegen sein Ziel unter Beibehaltung der β-Lactamase-Aktivität. Dies deutet darauf hin, dass die gemeinnützige und β-Lactamase Moieties funktionsfähig bleibt. In der vorliegenden Arbeit berichten wir ein detailliertes Protokoll, das unsere Hybrid-β-Lactamase-System der Biosensor-Technologie kombiniert. Die spezifische Bindung der gemeinnützige Ziel kann dank einer conductimetric Messung der Protonen durch die katalytische Aktivität des Enzyms freigegeben erkannt werden.
Introduction
Biosensoren sind analytische Geräte, die eine Bio-molekulare Interaktion mit physikalischen oder chemischen Signalgeber als Wandler1kombinieren. Die aufgezeichneten Signale können dann interpretiert und umgewandelt, um die Wechselwirkungen zwischen den freien und immobilisierten Partnern zu überwachen. Die meisten der Biosensoren beinhalten die Verwendung eines Antikörpers Analyten wie Hormone oder andere Erreger Marker2zu erkennen. Anderen Sensor-Formate können verwendet werden und sind Masse-basierte, magnetische, optische oder elektrochemische Biosensoren. Letztere gehören zu den am häufigsten verwendeten Sensoren und Funktion durch eine verbindliche Veranstaltung in ein elektrisches Signal umwandeln. Die Aufführungen und Empfindlichkeiten aller Antikörper-basierten Biosensoren sind stark abhängig von im Wesentlichen zwei Parameter: (i) die Qualität des Antikörpers und (Ii) die Eigenschaften des Systems verwendet, um das Signal2zu generieren.
Antikörper sind hochmolekulare Masse dimeres Proteine (150 – 160 kDa), die aus zwei schweren Ketten und zwei leichten Ketten bestehen. Die Interaktion zwischen den leichten und schweren Ketten wird meist durch hydrophobe Wechselwirkungen sowie eine konservierte Disulfid Bindung stabilisiert. Jede Kette enthält eine Variable Domäne, die mit dem Antigen im Wesentlichen über drei hypervariablen Regionen benannt ergänzende Bestimmung Regionen (CDR1-2-3) interagiert. Trotz der zahlreichen Fortschritte auf dem Gebiet der großen Ausdruck in voller Länge Antikörper mit kostengünstigen Expressionssysteme (z. B. E. Coli) führt oft zu der Produktion von instabilen und aggregierte Proteine. Deshalb verschiedene Antikörperfragmente entwickelt haben, wie z. B. Single-Chain Variable3 (ScFvs ≈ 25 kDa) Fragmente. Sie bestehen aus den Variablen Domänen von bzw. einem schweren und einem leichten Ketten, die durch eine synthetische Aminosäure-Sequenz kovalent verknüpft sind. Aber diese Fragmente häufig zeigen eine schlechte Stabilität und haben die Tendenz zu aggregieren, da sie einen Großteil ihrer hydrophoben Region zu Lösungsmittel4aussetzen. In diesem Zusammenhang scheinen einzelne Kette Kameliden Antikörperfragmente, genannt Nanobodies oder FHKW, hervorragende Alternativen zu ScFvs. Diese Domains entsprechen den Variablen Domänen der Kameliden Single-Kette Antikörper. Im Gegensatz zu herkömmlichen Antikörper Kameliden Antikörper sind frei von Lichterketten und enthalten nur zwei schwere Ketten5. Nanobodies sind daher die kleinste Monomeren Antikörperfragmente (12 kDa) Antigen ähnlich dem des herkömmlichen Antikörper6Affinität binden. Darüber hinaus präsentieren sie verbesserte Stabilität und Löslichkeit im Vergleich zu anderen Full-length Antikörper oder Antikörperfragmente. Zu guter Letzt lassen ihre kleine Größe und erweiterte CDR3 Schlaufen kryptische Epitope erkennen und binden Sie an Enzym aktiven Zentren7,8. Heute, diese Domains erhalten große Aufmerksamkeit und wurden auf die Biosensor-Technologie kombiniert. Z. B. Huang Et Al. entwickelten eine gemeinnützige-basierten Biosensor für die Erkennung und Quantifizierung von menschlichen Prostata-spezifischen Antigens (PSA)9.
Wie bereits erwähnt-oben ist ein wichtiger Parameter in Biosensor-Assays die Effizienz des Systems verwendet, um das elektrische Signal zu erzeugen. Aus diesem Grunde Enzymbasis elektrochemische Biosensoren immer größer werdende Aufmerksamkeit erregt haben und für verschiedene Anwendungen wie Gesundheit, Lebensmittelsicherheit und Umweltüberwachung verbreitet. Diese Biosensoren verlassen sich auf die katalytische Hydrolyse eines Substrats durch ein Enzym, das elektrische Signal zu generieren. In diesem Zusammenhang β-Lactamases erwiesen sich bestimmten, sensiblen und einfacher umzusetzen experimentell als viele andere Enzyme z. B. alkalische Phosphatase oder Meerrettich Peroxidase10. Β-Lactamases sind Enzyme, die für bakterielle Resistenz gegen β-Lactam-Antibiotika sind durch sie hydrolysieren. Sie sind Monomere, sehr stabil, effizient, und klein. Darüber hinaus generieren Domäne/Peptid Einfügungen in β-Lactamases bifunktionale Chimäre Proteinen, die gezeigt wurden, und effiziente Werkzeuge, um Protein-Ligand-Interaktionen zu untersuchen. In der Tat, haben jüngste Studien gezeigt, dass Einfügen von Variablen Antikörperfragmente in TEM1 β-Lactamase Ergebnisse in ein chimäres Protein, die in der Lage, mit hoher Affinität zu ihren Ziel-Antigen gebunden bleibt. Interessanterweise zeigte die Antigen-Bindung allosterische Verordnung TEM1 katalytische Aktivität11,12zu induzieren. Darüber hinaus zeigten wir in mehreren Studien, dass Protein Domäne einführen in eine permissive Schleife des Bacillus Licheniformis BlaP β-Lactamase Funktionsproteine Chimären erzeugt, die gut geeignet zur Überwachung von Protein-Ligand-Interaktionen13 ,14. Wir eingefügt vor kurzem eine gemeinnützige, Fahrerhaus-Lys3, in diesem freizügigen Insertionsstelle BlaP15benannt. Diese gemeinnützige zeigte an Henne-Ei-weiß Lysozym (HEWL) binden und seine enzymatische Aktivität16zu hemmen. Wir haben gezeigt, dass das erzeugte Hybrid-Protein, benannt BlaP-Fahrerhaus-Lys3, eine hohe Spezifität erhalten / Affinität gegen HEWL, während die β-Lactamase-Aktivität blieb unverändert. Dann haben wir erfolgreich kombiniert die β-Lactamase-Hybridtechnologie, eine elektrochemische Biosensor und zeigte, dass die Höhe der erzeugte elektrische Signal abhängig von der Interaktion zwischen BlaP-Fahrerhaus-Lys3 und HEWL auf einer Elektrode immobilisiert. Hydrolyse von β-Lactam-Antibiotika durch BlaP induziert in der Tat eine Proton-Release, die in einem quantitativen elektrisches Signal umgewandelt werden kann. Diese Kombination von β-Lactamase Hybridtechnik mit eine elektrochemische Biosensor ist schnell, empfindlich, quantitative und ermöglicht Echtzeit-Messung von das erzeugte Signal. Diese Methode wird hier beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Arbeit präsentieren wir eine Methode, um eine gemeinnützige Verwendung der BlaP β-Lactamase als ein Trägerprotein funktionalisieren und wir zeigen, dass wir die daraus resultierende Hybrid-Protein in eine potentiometrische Sensor-Assay erfolgreich umsetzen können. Die wichtigste Neuerung Aspekt unserer Arbeit im Vergleich zu anderen Biosensor-Assays ist die kovalente Kupplung Teil der Antikörper, die enzymatische Aktivität, die das elektrische Signal generiert. Dieses so genannte Proteintechnologie Einf?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren erkennen der wallonischen Region Belgiens im Rahmen der SENSOTEM und NANOTIC Forschungsprojekte sowie die nationalen Fonds für die wissenschaftliche Forschung (F.R.S.-F.N.R.S) für ihre finanzielle Unterstützung.
Materials
| Reagents | |||
| KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
| NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
| Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
| EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
| KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
| alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
| HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
| casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
| benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
| hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
| methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
| Laboratory consumables | |||
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
| Equipment | |||
| pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
| vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
| potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
| PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
| digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
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