השימוש β-lactamase מבוססי ביוסנסור Conductimetric Assay לזהות אינטראקציות למערכות ביולוגיות
Summary
בעבודה זו, אנו מדווחים על שיטה חדשה ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות ביוסנסור conductimetric מבוסס על טכנולוגיית β לקטמאז היברידית. שיטה זו מתבססת על שחרורו של פרוטונים על הידרוליזה של β-lactams.
Abstract
ביולוגיים הם הופכים יותר ויותר חשובה ולא יושם בתחומים שונים כגון זיהוי הפתוגן, אבחון מולקולרי, ניטור סביבתי, בקרת בטיחות מזון. בהקשר זה, השתמשנו β-lactamases כמו אנזימים כתב יעיל במספר מחקרים אינטראקציית חלבון-חלבון. יתר על כן, יכולתם לקבל הוספות של פפטידים או חלבונים מובנים/תחומים מאוד מעודדת את השימוש של אנזימים אלה כדי ליצור חלבונים chimeric. במחקר שנערך לאחרונה, אנחנו המוכנסים קטע תחום אחד נוגדן Bacillus licheniformis פדרליין β לקטמאז. אלה תחומים קטן, שנקרא גם nanobodies, מוגדרים על התחומים אנטיגן-איגוד של נוגדנים שרשרת אחת של גמליים. כמו נוגדנים שרשרת כפולה משותפת, הם מראים הזיקות גבוהה ו- specificities עבור המטרות שלהם. החלבון chimeric וכתוצאה מכך הציג משיכה גבוה נגד המטרה שלו תוך שמירה על הפעילות β לקטמאז. הדבר מצביע על כי nanobody וβ לקטמאז moieties נשארים פונקציונליים. בשנת העבודה הנוכחית, מדווחים פרוטוקול מפורט המשלבת למערכת שלנו β לקטמאז היברידית הטכנולוגיה ביוסנסור. הכריכה ספציפי של nanobody למטרה שלה ניתן להבחין בזכות יחידת מידה conductimetric הפרוטונים שפורסמו על ידי פעילות קטליטית של האנזים.
Introduction
ביולוגיים הם התקנים המשלבים של אינטראקציה ביו-מולקולרי עם התקני איתות פיזי או כימי המכונה מתמרים1. האותות מוקלטות יכול להיות לאחר מכן לפרש, המרה כדי לנטר את האינטראקציות בין בני הזוג קיבוע וחופשי. רוב ביולוגיים לערב את השימוש נוגדן לזהות analytes כגון הורמונים או סמנים הפתוגן שונים2. תבניות שונות חיישן יכול לשמש וכוללים ביולוגיים מבוססי-מסה, מגנטי, אופטי או אלקטרוכימי. האחרון בין הנפוץ ביותר בשימוש חיישנים, הפונקציה על-ידי המרת אירוע מחייב אות חשמלי. הופעות של רגישויות של כל נוגדן מבוססי ביולוגיים תלויים חריפה בעיקרו של דבר שני פרמטרים: i) האיכות של הנוגדן ומאפיינים ii) של מערכת המשמשת ליצירת אות2.
נוגדנים הם חלבונים dimeric מסה גבוהה-מולקולרית (150-160 kDa) המורכבות שתי שרשראות כבדות, שתי שרשראות אור. האינטראקציה בין הרשתות קל וכבד בעיקר מיוצב על ידי אינטראקציות הידרופוביות, כמו גם קשר דיסולפידי ההכפלה. בכל שרשרת כולל תחום משתנה אינטראקציה עם אנטיגן בעיקרו באמצעות שלושה אזורים hypervariable בשם משלימים קביעת אזורים (CDR1-2-3). למרות רבים בשטח, הביטוי בקנה מידה גדול של נוגדנים באורך מלא עם מערכות ביטוי נמוכים (למשל, e. coli) מובילה לעיתים קרובות לייצור של חלבונים לא יציב, צבורים. זו הסיבה מקטעי נוגדנים שונים יש מהונדס כגון משתנה יחיד-שרשרת קטעים3 (ScFvs ≈ 25 kDa). הם מורכבים של התחומים משתנה בהתאמה אחד כבד, שרשראות אור אחד אשר covalently מקושרים על ידי רצף חומצות אמיניות סינתטי. עם זאת, קטעים אלה לעתים קרובות להציג יציבות המסכן, יש נטייה לצבור, שכן הם חושפים חלק גדול של אזורים הידרופוביות שלהם עד הממס4. בהקשר זה, שרשרת יחיד גמליים נוגדן שברים, המכונה nanobodies או VHHs, נראה מצוין חלופות ScFvs. תחומים אלה תואמים התחומים משתנה של גמליים יחיד-שרשרת נוגדנים. בניגוד קונבנציונאלי נוגדנים, נוגדנים גמליים נטולי שרשראות אור, להכיל רק שתי שרשראות כבדות5. לכן, nanobodies הן הקטן נוגדן monomeric השברים (12 kDa) מסוגל לקשור אנטיגן עם זיקה דומה לזה של נוגדנים קונבנציונאלי6. בנוסף, הם מציגים יציבות משופרת, המסיסות בהשוואה נוגדנים באורך מלא או חלקי נוגדנים אחרים. לבסוף, שלהם בגדלים קטנים ולולאות CDR3 המורחבת שלהם מאפשרות להם לזהות epitopes נסתר, לאגד אנזים אתרים פעילים7,8. כיום, תחומים אלה מקבלים תשומת לב רבה, כבר בשילוב ביוסנסור לטכנולוגיה. לדוגמה, הואנג ואח. פיתחו של ביוסנסור nanobody מבוסס זיהוי, כימות של האנושי אנטיגן ספציפי הערמונית (PSA)9.
כמו שהוזכר-לעיל, הוא פרמטר חשוב במבחני ביוסנסור היעילות של המערכת המשמש ליצירת האות החשמלי. מסיבה זו, מבוססת אנזים ביולוגיים אלקטרוכימי משכו תשומת לב ההולכת וגדלה, היו בשימוש נרחב ליישומים שונים כגון בריאות, בטיחות המזון, וכן ניטור סביבתי. ביולוגיים אלה מסתמכים על הידרוליזה קטליטי של מצע על ידי אנזים כדי להפיק את האות החשמלי. בהקשר זה, β-lactamases הראו להם להיות יותר ספציפי, יותר רגיש, המאיצה השפעול יותר אנזימים רבים אחרים כגון phosphatase אלקליין או חזרת peroxidase10. Β-lactamases הם אנזימים שאחראים על עמידות חיידקים לאנטיביוטיקה β-לקטם מאת hydrolyzing אותם. הם monomeric, יציב מאוד, יעיל, בגודל קטן. יתר על כן, תחום/פפטיד הוספות לתוך β-lactamases ליצור חלבונים chimeric bi-פונקציונליים, כי הוצגו להיות כלי יעיל ללמוד אינטראקציות חלבון-ליגנד. ואכן, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו את ההכנסה של נוגדן קטעים משתנה לתוך TEM1 β לקטמאז התוצאות בחלבון chimeric הנשאר מסוגל לקשור עם זיקה גבוהה אנטיגן היעד שלה. מעניין, האיגוד אנטיגן הוצגה לזירוז אלוסטריה TEM1 פעילות קטליטית11,12. יתר על כן, אנחנו הראו מספר מחקרים כי חלבון תחום החדרת לתוך לולאה מתירני Bacillus licheniformis אייריש β לקטמאז מייצר חלבונים chimeric תפקודית מותאמים גם לפקח על אינטראקציות חלבון-ליגנד13 ,14. אנחנו לאחרונה נוסף nanobody, בשם המונית-Lys3, לתוך אתר זה ההכנסה ולקוד של אייריש-15. Nanobody זו הוצגה כדי לאגד חן-ביצה-לבן ליזוזים (HEWL), כדי לעכב את פעילות אנזימטי16. הראינו כי החלבון שנוצר היברידית, בשם אייריש-מונית-Lys3, נשמר ירידה לפרטים גבוה / זיקה נגד HEWL בעוד הפעילות β לקטמאז נותרה ללא שינוי. ואז אנו בהצלחה לשלב את הטכנולוגיה β לקטמאז היברידית ביוסנסור אלקטרוכימי, הראה כי כמות אות חשמלי שנוצר היה תלוי של האינטראקציה בין אייריש-מונית-Lys3 ו- HEWL ותשמרו על אלקטרודה. אכן, הידרוליזה של אנטיביוטיקה β lactam על ידי פדרליין גורם לשחרור פרוטון זה ניתן להמיר אות חשמלי כמותית. שילוב זה של הטכנולוגיה β לקטמאז היברידית עם ביוסנסור אלקטרוכימי מהיר, רגיש, כמותיים, ומאפשר בזמן אמת המידה של האות שנוצר. מתודולוגיה זו מתואר בזאת.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעבודה זו אנו מציגים שיטה functionalize nanobody באמצעות אייריש β לקטמאז כמו חלבון נשא ולהראות לנו כי אנחנו יכולים ליישם בהצלחה החלבון היברידית וכתוצאה מכך ב וזמינותו חיישן potentiometric. ההיבט חדשנות הראשי של העבודה שלנו לעומת מבחני ביוסנסור אחרים הוא זיווג קוולנטיות החלק נוגדן הפעילות האנזימטית מתרחש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים להכיר את ולוני אזור בלגיה במסגרת מחקריהם SENSOTEM ו- NANOTIC, כמו גם הלאומי כספים את המחקר המדעי (F.R.S.-F.N.R.S) לתמיכה הפיננסית שלהם.
Materials
| Reagents | |||
| KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
| NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
| Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
| EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
| KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
| alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
| HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
| casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
| benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
| hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
| methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
| Laboratory consumables | |||
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
| Equipment | |||
| pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
| vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
| potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
| PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
| digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
References
- Higgins, I. J., Lowe, C. R. Introduction to the principles and applications of biosensors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).
- Byrne, B., Stack, E., Gilmartin, N., O’Kennedy, R. Antibody-based sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins. Sensors (Basel). 9, 4407-4445 (2009).
- Huston, J. S., et al. Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5879-5883 (1988).
- Mechaly, A., Zahavy, E., Fisher, M. Development and implementation of a single-chain Fv antibody for specific detection of Bacillus anthracis spores. Appl Environ Microbiol. 74, 818-822 (2008).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Sheriff, S., Constantine, K. L. Redefining the minimal antigen-binding fragment. Nat Struct Biol. 3, 733-736 (1996).
- Stijlemans, B., et al. Efficient targeting of conserved cryptic epitopes of infectious agents by single domain antibodies. African trypanosomes as paradigm. J Biol Chem. 279, 1256-1261 (2004).
- Thanongsaksrikul, J., et al. A V H H that neutralizes the zinc metalloproteinase activity of botulinum neurotoxin type A. J Biol Chem. 285, 9657-9666 (2010).
- Huang, L., et al. Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays. Biosens. Bioelectron. 21, 483-490 (2005).
- Yolken, R. H., Wee, S. B., Van Regenmortel, M. The use of beta-lactamase in enzyme immunoassays for detection of microbial antigens. J Immunol Methods. 73, 109-123 (1984).
- Kojima, M., et al. Activation of circularly permutated beta-lactamase tethered to antibody domains by specific small molecules. Bioconjug Chem. 22, 633-641 (2011).
- Iwai, H., Kojima-Misaizu, M., Dong, J., Ueda, H. Creation of a Ligand-Dependent Enzyme by Fusing Circularly Permuted Antibody Variable Region Domains. Bioconjug Chem. 27, 868-873 (2016).
- Vandevenne, M., et al. The Bacillus licheniformis BlaP beta-lactamase as a model protein scaffold to study the insertion of protein fragments. Protein Sci. 16, 2260-2271 (2007).
- Vandevenne, M., et al. Rapid and easy development of versatile tools to study protein/ligand interactions. Protein Eng Des Sel. 21, 443-451 (2008).
- Crasson, O., et al. Enzymatic functionalization of a nanobody using protein insertion technology. Protein Eng Des Sel. 28, 451-460 (2015).
- Yunus, S., Attout, A., Vanlancker, G., Bertrand, P., Ruth, N., Galleni, G. A method to probe electrochemically active material state in portable sensor applications. Sensors and Actuators B: Chemical. 156, 35-42 (2011).
- Bogaerts, P., Yunus, S., Massart, M., Huang, T. D., Glupczynski, Y. Evaluation of the BYG Carba Test, a New Electrochemical Assay for Rapid Laboratory Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 54, 349-358 (2016).
- Wang, L. P., Wang, W., Di, L., Lu, Y. N., Wang, J. Y. Protein adsorption under electrical stimulation of neural probe coated with polyaniline. Colloids Surf B Biointerfaces. 80, 72-78 (2010).
- Piletsky, S., Piletska, E., Bossi, A., Turner, N., Turner, A. Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization. Biotechnol. Bioeng. 82, 86-92 (2003).
- Khatkhatay, M. I., Desai, M. A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase. J Immunoassay. 20, 151-183 (1999).
- Worn, A., et al. Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors. J Biol Chem. 275, 2795-2803 (2000).
- Ostermeier, M. Engineering allosteric protein switches by domain insertion. Protein Eng Des Sel. 18, 359-364 (2005).
- Choi, J. H., Laurent, A. H., Hilser, V. J., Ostermeier, M. Design of protein switches based on an ensemble model of allostery. Nat Commun. 6, 6968 (2015).
- Collinet, B., et al. Functionally accepted insertions of proteins within protein domains. J Biol Chem. 275, 17428-17433 (2000).
- Betton, J. M., Jacob, J. P., Hofnung, M., Broome-Smith, J. K. Creating a bifunctional protein by insertion of beta-lactamase into the maltodextrin-binding protein. Nat Biotechnol. 15, 1276-1279 (1997).
- Ay, J., Gotz, F., Borriss, R., Heinemann, U. Structure and function of the Bacillus hybrid enzyme GluXyn-1: native-like jellyroll fold preserved after insertion of autonomous globular domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6613-6618 (1998).
- Ruth, N., et al. DNA vaccination for the priming of neutralizing antibodies against non-immunogenic STa enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli. Vaccine. 23, 3618-3627 (2005).
- Zervosen, A., et al. Characterization of the cattle serum antibody responses against TEM beta-lactamase and the nonimmunogenic Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STaI). FEMS Immunol Med Microbiol. 54, 319-329 (2008).
- Chevigne, A., et al. Use of bifunctional hybrid beta-lactamases for epitope mapping and immunoassay development. J Immunol Methods. 320, 81-93 (2007).
- Ke, W., et al. Structure of an engineered beta-lactamase maltose binding protein fusion protein: insights into heterotropic allosteric regulation. PloS One. 7, 39168 (2012).
- Saeedfar, K., Heng, L. Y., Ling, T. L., Rezayi, M. Potentiometric urea biosensor based on an immobilised fullerene-urease bio-conjugate. Sensors (Basel). 13, 16851-16866 (2013).
- D’Orazio, P. Biosensors in clinical chemistry. Clin Chim Acta. 334, 41-69 (2003).
- Szucs, J., Pretsch, E., Gyurcsanyi, R. E. Potentiometric enzyme immunoassay using miniaturized anion-selective electrodes for detection. Analyst. 134, 1601-1607 (2009).
- Ding, J., Wang, X., Qin, W. Pulsed galvanostatic control of a polymeric membrane ion-selective electrode for potentiometric immunoassays. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 9488-9493 (2013).
- Wang, X., et al. A polymeric liquid membrane electrode responsive to 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine oxidation for sensitive peroxidase/peroxidase mimetic-based potentiometric biosensing. Anal Chem. 86, 4416-4422 (2014).
- Grieshaber, D., MacKenzie, R., Voros, J., Reimhult, E. Electrochemical Biosensors – Sensor Principles and Architectures. Sensors (Basel). 8, 1400-1458 (2008).
- Bakker, E., Pretsch, E. Nanoscale potentiometry. Trends Analyt Chem. 27, 612-618 (2008).
- Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosens Bioelectron. 75, 273-284 (2016).
- Nemiroski, A., et al. Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 11984-11989 (2014).
- . . Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union. , (2013).
