Användning av en β-laktamas-baserade Conductimetric Biosensor analysen att upptäcka Biomolekylers interaktion
Summary
I detta arbete rapporterar vi en ny metod att studera protein-protein interaktioner med hjälp av en conductimetric biosensor baserat på β-laktamas hybridtekniken. Denna metod förlitar sig på release av protons vid hydrolys av β-laktamer.
Abstract
Biosensorer blir alltmer viktigt och genomförs inom olika områden såsom upptäckt av patogen, Molekylärbiologisk diagnostik, miljöövervakning och säkerhet livsmedelskontroll. I detta sammanhang använde vi β-laktamaser som effektiv reporter enzymer i flera protein-protein interaktionsstudier. Dessutom, deras förmåga att acceptera införanden av peptider eller strukturerad proteiner/domäner starkt uppmuntrar användningen av dessa enzymer att generera chimära proteiner. I en färsk studie, vi förde in en enskild domän antikropp fragment i den Bacillus licheniformis BlaP β-laktamas. Dessa små domäner, även kallad nanobodies, definieras som antigen-bindande domänerna av enda kedja antikroppar från kameldjur. Som vanligt dubbel kedja antikroppar visar de hög tillhörighet och särdrag för sina mål. Det resulterande chimära proteinet uppvisade en hög affinitet mot sitt mål bibehållen aktiviteten β-laktamas. Detta tyder på att nanobody och β-laktamas beståndsdelarna förblir funktionella. I detta arbete rapporterar vi ett detaljerat protokoll som kombinerar vår β-laktamas hybridsystem biosensor-tekniken. Den specifika bindningen av nanobody till sitt mål kan upptäckas tack vare en conductimetric mätning av protonsna utgivet den katalytiska aktiviteten av enzymet.
Introduction
Biosensorer är analytiska enheter som kombinerar en bio-molekylär interaktion med fysikalisk eller kemisk signalering enheter avses som givare1. De inspelade signalerna kan sedan tolkas och konverteras för att övervaka samspelet mellan de immobiliserade och fri partnerna. De flesta av biosensorer innebär användning av en antikropp att upptäcka analyter såsom hormoner eller annan patogen markörer2. Olika sensorformat kan användas och inkluderar massa-baserade, magnetiska, optisk eller elektrokemisk biosensorer. Den senare är bland de vanligaste används sensorer, och fungerar genom att omvandla en bindande händelse till en elektrisk signal. Framföranden och känslighet för alla antikroppsbaserade biosensorer är starkt beroende av i huvudsak två parametrar: i) kvaliteten på antikroppen och ii) det system som används för att generera den signal2egenskaper.
Antikroppar är högmolekylära massa dimeriskt proteiner (150 – 160 kDa) som består av två tunga kedjor och två lätta kedjor. Samspelet mellan lätta och tunga kedjorna är mestadels stabiliseras av hydrofoba interaktioner samt en bevarade disulfide bond. Varje kedja innehåller en variabel domän som interagerar med antigenet i huvudsak via tre hypervariabel regioner heter kompletterande regioner (CDR1-2-3). Trots många framsteg inom fältet, storskaliga uttrycket av fullängds antikroppar med låg kostnad uttryck system (t.ex., E. coli) leder ofta till produktionen av instabil och aggregerade proteiner. Det är därför olika antikroppsfragment har konstruerats som singel-kedjan variabel fragment3 (ScFvs ≈ 25 kDa). De består av de variabla domänerna i respektive en tung och en lätta kedjor som är kovalent länkade med en syntetisk aminosyrasekvens. Men dessa fragment ofta visa en dålig stabilitet och har en tendens att aggregera eftersom de utsätter en stor del av sina hydrofoba regioner med lösningsmedel4. I detta sammanhang verkar enda kedja-kameldjur antikroppsfragment, kallad nanobodies eller VHHs, vara utmärkt alternativ till ScFvs. Dessa domäner motsvarar de variabla domänerna av kameldjur singel-kedjan antikroppar. Till skillnad från konventionella antikroppar, kameldjur antikroppar saknar lätta kedjor och endast innehålla två tunga kedjor5. Nanobodies är därför de minsta monomer antikroppsfragment (12 kDa) kan binda till antigen med en affinitet som liknar konventionella antikroppar6. De presenterar dessutom förbättrad stabilitet och löslighet jämfört med andra fullängds antikroppar eller antikroppsfragment. Slutligen, deras små storlekar och deras utökade CDR3 loopar tillåta dem att erkänna kryptiska epitoper och binder till enzymet aktiva platser7,8. Numera kan dessa domäner får stor uppmärksamhet och har kombinerats till biosensor tekniken. Till exempel Huang et al. har utvecklat en nanobody-baserade biosensor för påvisande och kvantifiering av humant prostataspecifikt antigen (PSA)9.
Som nämnts ovan är en viktig parameter i biosensor analyser effektiviteten i de system som används för att generera en elektrisk signal. Av denna anledning enzym-baserade elektrokemiska biosensorer har uppmärksammats alltmer och har använts allmänt för olika applikationer såsom hälsovård, livsmedelssäkerhet och miljöövervakning. Dessa biosensorer lita på katalytisk hydrolys av ett substrat av ett enzym att generera en elektrisk signal. I detta sammanhang visade β-laktamaser sig vara mer specifik, känslig och lättare att genomföra experimentellt än många andra enzymer såsom alkaliskt fosfatas eller pepparrotperoxidas10. Β-laktamaser är enzymer som ansvarar för bakteriell resistens mot β-laktamantibiotika av screening dem. De är monomer, mycket stabil, effektiv, och för liten storlek. Dessutom genererar domän/peptid infogningar i β-laktamaser bi-funktionella chimära proteiner som visade sig vara effektiva verktyg att studera protein-ligand interaktioner. Faktiskt, nya studier har visat att införandet av variabel antikroppsfragment i TEM1 β-laktamas resultaten i en chimär protein som återstår kan binda med hög affinitet till dess målet antigen. Intressant, visades antigen bindningen att inducera Alloster reglering av TEM1 katalytisk aktivitet11,12. Dessutom visade vi i flera studier att protein domän införande i en tillåtande loop av Bacillus licheniformis BlaP β-laktamas genererar funktionella chimära proteiner som är väl lämpade att övervaka protein-ligand interaktioner13 ,14. Vi har nyligen in en nanobody, heter cAb-Lys3, i denna tillåtande insticksstället BlaP15. Denna nanobody visades att binda till höna-ägg-vit lysozym (HEWL) och hämma dess enzymatiska aktivitet16. Vi visade att proteinet genererade hybrid, heter BlaP-cAb-Lys3, behöll en hög specificitet / affinitet mot HEWL medan aktiviteten β-laktamas förblev oförändrad. Sedan vi framgångsrikt kombinerat β-laktamas hybridtekniken till en elektrokemisk biosensor och visade att mängden genererat elektrisk signal var beroende av samspelet mellan BlaP-cAb-Lys3 och HEWL orörlig på en elektrod. Faktiskt, hydrolys av β-laktamantibiotika av BlaP inducerar en proton release som kan omvandlas till en kvantitativ elektrisk signal. Denna kombination av β-laktamas hybridtekniken med en elektrokemisk biosensor är kvantitativa, snabb, känslig, och tillåter realtid mätning av den genererade signalen. Denna metod beskrivs häri.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta arbete vi presenterar en metod för att functionalize en nanobody med den BlaP β-laktamas som ett carrier protein och vi visar att vi framgångsrikt kan genomföra det resulterande hybrid proteinet i en potentiometrisk sensor-analys. Den viktigaste nyheten aspekten av vårt arbete jämfört med andra biosensor analyser är kovalent kopplingen å antikropp till enzymatisk aktivitet som genererar elektriska signalen. Denna så kallade protein införande teknik presenterar fördelar och begränsningar som kommer at…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner Belgiens vallonska regionen inom ramen för de SENSOTEM och NANOTIC forskningsprojekt samt nationella medel för den vetenskapliga forskningen (F.R.S.-F.N.R.S) för deras ekonomiska stöd.
Materials
| Reagents | |||
| KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
| NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
| Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
| EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
| KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
| alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
| HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
| casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
| benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
| hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
| methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
| Laboratory consumables | |||
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
| Equipment | |||
| pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
| vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
| potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
| PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
| digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
References
- Higgins, I. J., Lowe, C. R. Introduction to the principles and applications of biosensors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).
- Byrne, B., Stack, E., Gilmartin, N., O’Kennedy, R. Antibody-based sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins. Sensors (Basel). 9, 4407-4445 (2009).
- Huston, J. S., et al. Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5879-5883 (1988).
- Mechaly, A., Zahavy, E., Fisher, M. Development and implementation of a single-chain Fv antibody for specific detection of Bacillus anthracis spores. Appl Environ Microbiol. 74, 818-822 (2008).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Sheriff, S., Constantine, K. L. Redefining the minimal antigen-binding fragment. Nat Struct Biol. 3, 733-736 (1996).
- Stijlemans, B., et al. Efficient targeting of conserved cryptic epitopes of infectious agents by single domain antibodies. African trypanosomes as paradigm. J Biol Chem. 279, 1256-1261 (2004).
- Thanongsaksrikul, J., et al. A V H H that neutralizes the zinc metalloproteinase activity of botulinum neurotoxin type A. J Biol Chem. 285, 9657-9666 (2010).
- Huang, L., et al. Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays. Biosens. Bioelectron. 21, 483-490 (2005).
- Yolken, R. H., Wee, S. B., Van Regenmortel, M. The use of beta-lactamase in enzyme immunoassays for detection of microbial antigens. J Immunol Methods. 73, 109-123 (1984).
- Kojima, M., et al. Activation of circularly permutated beta-lactamase tethered to antibody domains by specific small molecules. Bioconjug Chem. 22, 633-641 (2011).
- Iwai, H., Kojima-Misaizu, M., Dong, J., Ueda, H. Creation of a Ligand-Dependent Enzyme by Fusing Circularly Permuted Antibody Variable Region Domains. Bioconjug Chem. 27, 868-873 (2016).
- Vandevenne, M., et al. The Bacillus licheniformis BlaP beta-lactamase as a model protein scaffold to study the insertion of protein fragments. Protein Sci. 16, 2260-2271 (2007).
- Vandevenne, M., et al. Rapid and easy development of versatile tools to study protein/ligand interactions. Protein Eng Des Sel. 21, 443-451 (2008).
- Crasson, O., et al. Enzymatic functionalization of a nanobody using protein insertion technology. Protein Eng Des Sel. 28, 451-460 (2015).
- Yunus, S., Attout, A., Vanlancker, G., Bertrand, P., Ruth, N., Galleni, G. A method to probe electrochemically active material state in portable sensor applications. Sensors and Actuators B: Chemical. 156, 35-42 (2011).
- Bogaerts, P., Yunus, S., Massart, M., Huang, T. D., Glupczynski, Y. Evaluation of the BYG Carba Test, a New Electrochemical Assay for Rapid Laboratory Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 54, 349-358 (2016).
- Wang, L. P., Wang, W., Di, L., Lu, Y. N., Wang, J. Y. Protein adsorption under electrical stimulation of neural probe coated with polyaniline. Colloids Surf B Biointerfaces. 80, 72-78 (2010).
- Piletsky, S., Piletska, E., Bossi, A., Turner, N., Turner, A. Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization. Biotechnol. Bioeng. 82, 86-92 (2003).
- Khatkhatay, M. I., Desai, M. A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase. J Immunoassay. 20, 151-183 (1999).
- Worn, A., et al. Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors. J Biol Chem. 275, 2795-2803 (2000).
- Ostermeier, M. Engineering allosteric protein switches by domain insertion. Protein Eng Des Sel. 18, 359-364 (2005).
- Choi, J. H., Laurent, A. H., Hilser, V. J., Ostermeier, M. Design of protein switches based on an ensemble model of allostery. Nat Commun. 6, 6968 (2015).
- Collinet, B., et al. Functionally accepted insertions of proteins within protein domains. J Biol Chem. 275, 17428-17433 (2000).
- Betton, J. M., Jacob, J. P., Hofnung, M., Broome-Smith, J. K. Creating a bifunctional protein by insertion of beta-lactamase into the maltodextrin-binding protein. Nat Biotechnol. 15, 1276-1279 (1997).
- Ay, J., Gotz, F., Borriss, R., Heinemann, U. Structure and function of the Bacillus hybrid enzyme GluXyn-1: native-like jellyroll fold preserved after insertion of autonomous globular domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6613-6618 (1998).
- Ruth, N., et al. DNA vaccination for the priming of neutralizing antibodies against non-immunogenic STa enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli. Vaccine. 23, 3618-3627 (2005).
- Zervosen, A., et al. Characterization of the cattle serum antibody responses against TEM beta-lactamase and the nonimmunogenic Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STaI). FEMS Immunol Med Microbiol. 54, 319-329 (2008).
- Chevigne, A., et al. Use of bifunctional hybrid beta-lactamases for epitope mapping and immunoassay development. J Immunol Methods. 320, 81-93 (2007).
- Ke, W., et al. Structure of an engineered beta-lactamase maltose binding protein fusion protein: insights into heterotropic allosteric regulation. PloS One. 7, 39168 (2012).
- Saeedfar, K., Heng, L. Y., Ling, T. L., Rezayi, M. Potentiometric urea biosensor based on an immobilised fullerene-urease bio-conjugate. Sensors (Basel). 13, 16851-16866 (2013).
- D’Orazio, P. Biosensors in clinical chemistry. Clin Chim Acta. 334, 41-69 (2003).
- Szucs, J., Pretsch, E., Gyurcsanyi, R. E. Potentiometric enzyme immunoassay using miniaturized anion-selective electrodes for detection. Analyst. 134, 1601-1607 (2009).
- Ding, J., Wang, X., Qin, W. Pulsed galvanostatic control of a polymeric membrane ion-selective electrode for potentiometric immunoassays. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 9488-9493 (2013).
- Wang, X., et al. A polymeric liquid membrane electrode responsive to 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine oxidation for sensitive peroxidase/peroxidase mimetic-based potentiometric biosensing. Anal Chem. 86, 4416-4422 (2014).
- Grieshaber, D., MacKenzie, R., Voros, J., Reimhult, E. Electrochemical Biosensors – Sensor Principles and Architectures. Sensors (Basel). 8, 1400-1458 (2008).
- Bakker, E., Pretsch, E. Nanoscale potentiometry. Trends Analyt Chem. 27, 612-618 (2008).
- Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosens Bioelectron. 75, 273-284 (2016).
- Nemiroski, A., et al. Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 11984-11989 (2014).
- . . Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union. , (2013).
