고감도 현미경을 이용한 세포 산화 환원 프로파일 링
Summary
이 논문은 세포 내 ROS 수준과 미토콘드리아 막 전위와 형태학을 동시에 정량화하기위한 고 – 내용 현미경 검사 워크 플로우를 제시한다. 세포 투과성 형광 리포터 분자 5- (and- 6) – 클로로 메틸 -2 ', 7'- 디클로로 디 히드로 플루 오렌 시스 디 아세테이트, 아세틸 에스테르 (CM-H 2 DCFDA) 및 테트라 메틸 로다 민 메틸 에스테르 (TMRM)
Abstract
활성 산소 종 (ROS)은 유전자 발현, 이동, 분화 및 증식을 포함한 필수 세포 과정을 조절합니다. 그러나 과도한 ROS 수준은 DNA, 지질 및 단백질에 대한 비가 역적 산화 손상을 수반하는 산화 스트레스 상태를 유도합니다. 따라서, ROS의 정량화는 세포 건강 상태에 대한 직접적인 프록시를 제공한다. 미토콘드리아가 ROS의 중요한 세포 원 및 표적이기 때문에 같은 세포에서 미토콘드리아 기능과 ROS 생산의 공동 분석은 병리 생리 학적 조건에서 상호 연결을 더 잘 이해하는 데 중요합니다. 따라서, 세포 내 ROS 수준, 미토콘드리아 막 잠재력 (ΔΨ m ) 및 미토콘드리아 형태학의 동시 정량화를위한 고 함량 현미경 기반 전략이 개발되었습니다. 그것은 다중 웰 플레이트에서 성장한 살아있는 부착 세포의 자동화 된 광역 형광 현미경 및 이미지 분석에 기반을두고 있습니다.세포 – 투과성 형광 리포터 분자 CM-H2 DCFDA (ROS) 및 TMRM (ΔΨm 및 미토콘드리아 형태학)을 사용하여 d를 측정 하였다. 형광 측정 또는 유동 세포 계측법과는 달리,이 전략은 실험 자극 전후 모두 높은 시공간 해상도를 갖는 개별 세포 수준에서 세포 매개 변수를 정량화 할 수 있습니다. 중요하게도,이 방법의 이미지 기반 성질은 신호 강도 이외에 형태 론적 파라미터를 추출 할 수있게한다. 결합 된 기능 세트는 하위 집단, 세포 유형 및 / 또는 치료법 간의 차이를 탐지하기위한 탐색 및 통계 다변량 데이터 분석에 사용됩니다. 여기에, 화학 섭동 후 세포 상태 사이의 모호하지 않은 차별을위한 잠재력을 증명하는 실험 예와 함께 분석에 대한 자세한 설명이 제공됩니다.
Introduction
세포 내 ROS의 농도는 ROS 생성 시스템과 ROS를 제거하는 시스템 사이의 동적 상호 작용을 통해 세 심하게 조절됩니다. 이 둘의 불균형은 산화 스트레스 상태를 일으킨다. ROS의 주요 원인 중 하나는 미토콘드리아이다. 세포 호흡에서의 역할을 감안할 때, 그들은 세포 내 superoxide (O 2 • – ) 분자의 대부분을 담당합니다 2 . 이것은 주로 강한 마이너스 내부 미토콘드리아 막 잠재력 (Δψ m ), 즉 미토콘드리아 과분극 조건 하에서 전자 전달 사슬의 복합체 1에서 O 2 로의 전자 누출에 기인한다. 반면에 mitochondrial depolarization은 ROS 생성 증가와 상호 작용하여 여러 형태의 작용 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 . 또한 핵분열 – 핵융합 기계 단백질의 산화 환원 변형을 통해 ROS는 미토콘드리아 형태를 공동 조절한다. 예를 들어, 단편화는 ROS 생성 및 세포 사멸 증가와 관련이있다 10 , 11 , 섬유 성 미토콘드리아는 영양 기아와 보호 mitophagy 12 . 세포 ROS와 미토콘드리아 morphofunction 사이의 복잡한 관계를 감안할 때, 둘 다 살아있는 세포에서 동시에 정량화되어야합니다. 정확하게 이것을 수행하기 위해, 형광 프로브 CM-H 2 DCFDA (ROS) 및 TMRM (미토콘드리아 Δψm 및 형태학)으로 염색 된 부착 세포 배양 물의 자동화 된 와이드 필드 현미경 및 이미지 분석에 기초하여 고 – 컨텐츠 이미징 분석법을 개발 하였다. 고 – 컨텐츠 이미징은 sp다중 보완 마커 및 자동화 된 이미지 분석을 사용하여 세포 phenotypes에 대해 atiotemporally 풍부한 ( 즉 , 많은 설명 기능) 정보. 자동화 된 현미경 검사와 결합하면 많은 샘플을 병렬로 ( 즉 높은 처리량) 스크리닝 할 수 있으므로 분석의 통계 능력이 향상됩니다. 사실, 프로토콜의 주요 자산은 같은 세포에서 여러 매개 변수의 동시 부량을 허용하고, 이것은 많은 세포 및 조건에서 가능하다는 것입니다.
프로토콜은 8 부분으로 나누어 져 있습니다 (아래의 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다) : 1) 96- 웰 플레이트에서 세포를 시드; 2) 원액, 작업 용액 및 영상 버퍼의 준비; 3) 현미경 셋업; 4) CM-H 2 DCFDA 및 TMRM으로 세포를 로딩하는 단계; 5) 기본 ROS 수준과 미토콘드리아 morphofunction을 측정하는 최초의 라이브 영상 라운드; 6) tert- 부틸의 첨가 후 둥근 두번째 이미지 생성유도 된 ROS 수준을 측정하기위한 과산화수소 (TBHP); 7) 자동화 된 이미지 분석; 8) 데이터 분석, 품질 관리 및 시각화.
이 분석법은 원래 정상적인 사람 피부 섬유 아세포 (NHDF)를 위해 개발되었습니다. 이러한 세포는 크고 평평하기 때문에 2D 와이드 이미지 13 , 14 에서 미토콘드리아 형태학을 평가하는 데 적합합니다. 그러나 사소한 수정으로이 방법은 다른 접착 세포 유형에도 적용 할 수 있습니다. 또한, CM-H 2 DCFDA와 TMRM의 조합 옆에 워크 플로우는 다른 분자 특이성 1 , 15 의 다양한 형광 염료 쌍을 준수합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문은 NHDF에서 세포 내 ROS 수준과 미토콘드리아 morphofunction의 동시 정량화를위한 고 함량 현미경 검사법을 설명합니다. 그 성능은 SQV가 처리 된 NHDF에 대한 사례 연구를 통해 입증되었습니다. 그 결과는 별도의 실험 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 <su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the University of Antwerp (TTBOF/29267, TTBOF/30112), the Special Research Fund of Ghent University (project BOF/11267/09), NB-Photonics (Project code 01-MR0110) and the CSBR (Centers for Systems Biology Research) initiative from the Netherlands Organization for Scientific Research (NWO; No: CSBR09/013V). Parts of this manuscript have been adapted from another publication1, with permission of Springer. The authors thank Geert Meesen for his help with the widefield microscope.
Materials
| Reagents | |||
| Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) | ThermoFisher Scientific | T668 | |
| CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | ThermoFisher Scientific | C6827 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma)Aldrich | D8418 | |
| MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded | Brooks life science systems | MGB096-1-2-LG-L | |
| HBSS w/o Phenol Red 500 ml | Lonza | BE10-527F | |
| DMEM high glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg | Lonza | BE17-516F | |
| HEPES 1M 500mL | Lonza | 17-737F | |
| Trypsin-Versene (EDTA) Solution | Lonza | BE17-161E | |
| Cy3 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-166-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-546-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Nikon Ti eclipse widefield microscope | Nikon | ||
| Perfect Focus System (PFS) | Nikon | hardware-based autofocus system | |
| CFI Plan Apo Lambda 20x objective | Nikon | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module | Nikon | This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol | |
| ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g | |||
| RStudio Version 1.0.44 | Rstudio | ||
| R version 3.3.2 |
References
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