В настоящей статье представлен технологический процесс высококонцентрированной микроскопии для одновременной количественной оценки внутриклеточных уровней ROS, а также потенциала и морфологии митохондриальной мембраны – совместно называемой морфофункциональной функцией митохондрий – в живых адгезивных клетках с использованием флуоресцентных репортерных молекул клеток 5- (и / 6) -хлорметил-2 ', 7'-дихлордигидрофлуоресцеиндиацетат, сложный ацетил (CM-H 2 DCFDA) и метиловый эфир тетраметилродамина (TMRM).
Реактивные виды кислорода (ROS) регулируют основные клеточные процессы, включая экспрессию генов, миграцию, дифференцировку и пролиферацию. Однако чрезмерные уровни ROS вызывают состояние окислительного стресса, что сопровождается необратимым окислительным повреждением ДНК, липидов и белков. Таким образом, количественное определение ROS обеспечивает прямой прокси для состояния клеточного здоровья. Поскольку митохондрии входят в число основных клеточных источников и мишеней АФК, совместный анализ митохондриальной функции и продукции АФК в одних и тех же клетках имеет решающее значение для лучшего понимания взаимосвязи в патофизиологических условиях. Поэтому была разработана стратегия с высоким содержанием микроскопа для одновременной количественной оценки внутриклеточных уровней ROS, потенциала митохондриальной мембраны (ΔΨ m ) и морфологии митохондрий. Он основан на автоматизированной флуоресцентной флуоресцентной микроскопии и анализе изображений живых клеток, выращенных в многолуночных планшетах, и стеанеD с клеточно-проницаемыми флуоресцентными репортерными молекулами CM-H 2 DCFDA (ROS) и TMRM (ΔΨ m и митохондриальной морфологией). В отличие от флуориметрии или проточной цитометрии эта стратегия позволяет количественно определять субклеточные параметры на уровне отдельной клетки с высоким пространственно-временным разрешением, как до, так и после экспериментальной стимуляции. Важно отметить, что основанный на изображении характер метода позволяет экстрагировать морфологические параметры в дополнение к интенсивностям сигналов. Комбинированный набор функций используется для исследовательского и статистического многомерного анализа данных для выявления различий между субпопуляциями, типами клеток и / или обработками. Здесь приводится подробное описание анализа, а также примерный эксперимент, который доказывает его потенциал для однозначного различения между клеточными состояниями после химического возмущения.
Концентрация внутриклеточных ROS тщательно регулируется посредством динамического взаимодействия между ROS-продуцированием и системами разжижения ROS. Дисбаланс между ними провоцирует состояние окислительного стресса. Среди основных источников ROS – митохондрии 1 . Учитывая их роль в клеточном дыхании, они отвечают за объем внутриклеточных молекул супероксида (O 2 • – ) 2 . Это в основном связано с утечкой электрона в O 2 в комплексе 1 цепи переноса электронов в условиях сильного отрицательного внутреннего мембранного потенциала митохондрий (Δψ m ), т.е. митохондриальной гиперполяризации. С другой стороны, митохондриальная деполяризация также коррелирует с увеличением продукции ROS, указывая на множественные способы действия 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 . Кроме того, с помощью окислительно-восстановительных модификаций в белках механизмов деления-слияния РОС совместно регулирует митохондриальную морфологию 9. Например, фрагментация коррелирует с повышением продукции АФК и апоптозом 10 , 11 , тогда как нитевидные митохондрии связаны с питательным голоданием и защитой от Митофагия 12 . Учитывая сложную взаимосвязь между клеточной АФК и морфофункциональной функцией митохондрий, в идеале их следует количественно определять одновременно в живых клетках. Для этого был разработан анализ изображений с высоким содержанием, основанный на автоматизированной широкополосной микроскопии и анализе изображений клеточных культур, окрашенных флуоресцентными зондами CM-H 2 DCFDA (ROS) и TMRM (митохондриальная Δψ m и морфология). Отображение с высоким содержанием относится к извлечению sp(То есть , большое количество описательных признаков) информацию о клеточных фенотипах с использованием множественных комплементарных маркеров и автоматизированный анализ изображений. В сочетании с автоматизированной микроскопией многие образцы можно скринировать параллельно ( т.е. с высокой пропускной способностью), тем самым увеличивая статистическую мощность анализа. В самом деле, основным преимуществом протокола является то, что он позволяет одновременно количественно определять несколько параметров в одной и той же ячейке, и это для большого количества ячеек и условий.
Протокол разделен на 8 частей (подробно описанных в протоколе ниже): 1) Посеяющие клетки в 96-луночном планшете; 2) приготовление исходных растворов, рабочих растворов и буфера для визуализации; 3) Настройка микроскопа; 4) загрузка клеток DCFDA и TMRM CM-H 2 ; 5) Первая визуализация в реальном времени для измерения базальных уровней ROS и митохондриальной морфофункциональности; 6) Второе изображение в реальном времени после добавления трет -бутилПероксид (TBHP) для измерения индуцированных уровней ROS; 7) Автоматизированный анализ изображений; 8) Анализ данных, контроль качества и визуализация.
Этот анализ был первоначально разработан для нормальных человеческих дермальных фибробластов (NHDF). Так как эти клетки большие и плоские, они хорошо подходят для оценки морфологии митохондрий в двумерных широкопольных изображениях 13 , 14 . Однако, с небольшими изменениями, этот метод применим к другим типам адгезивных клеток. Кроме того, рядом с комбинацией DCFDA CM-H 2 и TMRM рабочий процесс соответствует множеству пар флуоресцентных красителей с различными молекулярными особенностями 1 , 15 .
В данной статье описывается метод микроскопии высокого содержания для одновременной количественной оценки внутриклеточных уровней ROS и митохондриальной морфофункциональности в NHDF. Его эффективность была продемонстрирована на примере исследования SQV-обработанных NHDF. Результаты под…
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the University of Antwerp (TTBOF/29267, TTBOF/30112), the Special Research Fund of Ghent University (project BOF/11267/09), NB-Photonics (Project code 01-MR0110) and the CSBR (Centers for Systems Biology Research) initiative from the Netherlands Organization for Scientific Research (NWO; No: CSBR09/013V). Parts of this manuscript have been adapted from another publication1, with permission of Springer. The authors thank Geert Meesen for his help with the widefield microscope.
Reagents | |||
Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) | ThermoFisher Scientific | T668 | |
CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | ThermoFisher Scientific | C6827 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma)Aldrich | D8418 | |
MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded | Brooks life science systems | MGB096-1-2-LG-L | |
HBSS w/o Phenol Red 500 ml | Lonza | BE10-527F | |
DMEM high glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg | Lonza | BE17-516F | |
HEPES 1M 500mL | Lonza | 17-737F | |
Trypsin-Versene (EDTA) Solution | Lonza | BE17-161E | |
Cy3 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-166-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-546-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Nikon Ti eclipse widefield microscope | Nikon | ||
Perfect Focus System (PFS) | Nikon | hardware-based autofocus system | |
CFI Plan Apo Lambda 20x objective | Nikon | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module | Nikon | This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol | |
ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g | |||
RStudio Version 1.0.44 | Rstudio | ||
R version 3.3.2 |