In dit artikel wordt een microscopie-werkstroom voor hoge inhoud voor gelijktijdige kwantificering van intracellulaire ROS-niveaus aangeboden, evenals mitochondriale membraanpotentiaal en morfologie – gezamenlijk aangeduid als mitochondriale morfofunctie – in levend aanhechtende cellen met behulp van de celdoorlatende fluorescerende reportermoleculen 5- (en- 6) -chloormethyl-2 ', 7'-dichloordihydrofluoresceendiacetaat, acetylester (CM-H2 DCFDA) en tetramethylrhodamine methylester (TMRM).
Reactieve zuurstofsoorten (ROS) regelen essentiële cellulaire processen, waaronder genuitdrukking, migratie, differentiatie en proliferatie. Overmatige ROS-niveaus veroorzaken echter een toestand van oxidatieve stress, die gepaard gaat met onomkeerbare oxidatieve schade aan DNA, lipiden en eiwitten. Zo geeft kwantificering van ROS een directe proxy voor cellulaire gezondheidstoestand. Aangezien mitochondriën tot de belangrijkste cellulaire bronnen en doelstellingen van ROS behoren, is gezamenlijke analyse van mitochondriale functie en ROS-productie in dezelfde cellen van cruciaal belang voor het beter begrijpen van de interconnectie in pathofysiologische omstandigheden. Daarom is een microscopie gebaseerde strategie ontwikkeld voor gelijktijdige kwantificering van intracellulaire ROS niveaus, mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨ m ) en mitochondriale morfologie. Het is gebaseerd op geautomatiseerde widefield fluorescentiemicroscopie en beeldanalyse van levende aanhechtende cellen, gegroeid in platen met meerdere putjes en staineD met de celdoorlatende fluorescerende reportermoleculen CM-H 2 DCFDA (ROS) en TMRM (ΔΨ m en mitochondriale morfologie). In tegenstelling tot fluorimetrie of flowcytometrie, kan deze strategie kwantificering van subcellulaire parameters op het niveau van de individuele cel met hoge spatiotemporale resolutie, zowel voor als na experimentele stimulatie. Belangrijk is dat de beeldgebaseerde aard van de werkwijze het mogelijk maakt om morfologische parameters te extraheren naast signaalintensiteiten. De gecombineerde funktieset wordt gebruikt voor exploratieve en statistische multivariate data-analyse om verschillen tussen subpopulaties, celtypes en / of behandelingen te detecteren. Hier wordt een gedetailleerde beschrijving van de analyse verstrekt, samen met een voorbeeld-experiment dat zijn potentieel voor ondubbelzinnige discriminatie tussen cellulaire staten bewijst na chemische verstoring.
De concentratie van intracellulaire ROS wordt nauwgezet gereguleerd door een dynamisch wisselwerking tussen ROS-producerende en ROS-defusing systemen. Onevenwicht tussen de twee veroorzaakt een staat van oxidatieve stress. Onder de belangrijkste bronnen van ROS zijn mitochondriën 1 . Gezien hun rol in cellulaire ademhaling, zijn ze verantwoordelijk voor het grootste deel van intracellulaire superoxide (O 2 • – ) moleculen 2 . Dit komt voornamelijk uit elektronleklek op O2 bij complex 1 van de elektron transportketting onder omstandigheden van sterk negatief innerlijk mitochondriaal membraanpotentieel (ψψ m ), dat wil zeggen mitochondriale hyperpolarisatie. Aan de andere kant is mitochondriale depolarisatie ook gecorreleerd met verhoogde ROS-productie die wijst op meerdere werkingsmethoden 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 . Door middel van redoxmodificaties in eiwitten van de splitsingsfusie-machines coördineren ROS de mitochondriale morfologie 9. Bijvoorbeeld, fragmentatie is gecorreleerd met verhoogde ROS-productie en apoptose 10 , 11 , terwijl filamente mitochondriën zijn gekoppeld aan voedingshongersnood en bescherming tegen Mitofagie 12 . Gezien de ingewikkelde relatie tussen cellulaire ROS en mitochondriale morfofunctie, zouden beide ideaal gelijktijdig in levende cellen gekwantificeerd moeten worden. Om dit precies te doen, werd een hoogwaardige beeldbepalingstest ontwikkeld op basis van geautomatiseerde widefieldmicroscopie en beeldanalyse van aanhechtende celculturen die gekleurd zijn met de fluorescerende probes CM-H 2 DCFDA (ROS) en TMRM (mitochondriale Δψ m en morfologie). High-content beeldvorming verwijst naar de extractie van spAtiotemporally rich ( dat wil zeggen een groot aantal beschrijvende eigenschappen) informatie over cellulaire fenotypen met behulp van meerdere complementaire markers en geautomatiseerde beeldanalyses. In combinatie met geautomatiseerde microscopie kunnen veel monsters parallel worden gescreend ( dwz hoge doorvoer), waardoor de statistische kracht van de test wordt verhoogd. Inderdaad, een belangrijk voordeel van het protocol is dat het gelijktijdige kwantificering van meerdere parameters in dezelfde cel mogelijk maakt, en dit voor een groot aantal cellen en condities.
Het protocol is verdeeld in 8 delen (in detail beschreven in het protocol hieronder): 1) Zaadcellen in een 96-putjesplaat; 2) Bereiding van voorraadoplossingen, werkoplossingen en afbeeldingsbuffer; 3) Opstelling van de microscoop; 4) Laden van de cellen met CM-H2 DCFDA en TMRM; 5) Eerste live imaging ronde om basale ROS niveaus en mitochondriale morphofunction te meten; 6) Tweede live imaging ronde na toevoeging van tert -butylPeroxide (TBHP) om geïnduceerde ROS niveaus te meten; 7) Automatische beeldanalyse; 8) Gegevensanalyse, kwaliteitscontrole en visualisatie.
De test werd oorspronkelijk ontwikkeld voor normale humane dermale fibroblasten (NHDF). Aangezien deze cellen groot en plat zijn, zijn ze goed geschikt voor het beoordelen van mitochondriale morfologie in 2D breedbeeldbeelden 13 , 14 . Echter, met kleine wijzigingen, is deze methode van toepassing op andere aanhechtende celtypes. Bovendien, naast de combinatie van CM-H 2 DCFDA en TMRM, voldoet de workflow aan een verscheidenheid aan fluorescerende kleurstofparen met verschillende moleculaire specificaties 1 , 15 .
Dit document beschrijft een microscopiemethode met hoge inhoud voor de gelijktijdige kwantificering van intracellulaire ROS-niveaus en mitochondriale morfofunctie in NHDF. Zijn prestatie werd aangetoond met een casestudy over SQV-behandelde NHDF. De resultaten ondersteunen eerder bewijs uit de literatuur waarin verhoogde ROS niveaus of mitochondriale dysfunctie zijn waargenomen na behandeling met type 1 HIV protease remmers, zij het in afzonderlijke experimenten 19 , …
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the University of Antwerp (TTBOF/29267, TTBOF/30112), the Special Research Fund of Ghent University (project BOF/11267/09), NB-Photonics (Project code 01-MR0110) and the CSBR (Centers for Systems Biology Research) initiative from the Netherlands Organization for Scientific Research (NWO; No: CSBR09/013V). Parts of this manuscript have been adapted from another publication1, with permission of Springer. The authors thank Geert Meesen for his help with the widefield microscope.
Reagents | |||
Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) | ThermoFisher Scientific | T668 | |
CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | ThermoFisher Scientific | C6827 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma)Aldrich | D8418 | |
MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded | Brooks life science systems | MGB096-1-2-LG-L | |
HBSS w/o Phenol Red 500 ml | Lonza | BE10-527F | |
DMEM high glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg | Lonza | BE17-516F | |
HEPES 1M 500mL | Lonza | 17-737F | |
Trypsin-Versene (EDTA) Solution | Lonza | BE17-161E | |
Cy3 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-166-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-546-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Nikon Ti eclipse widefield microscope | Nikon | ||
Perfect Focus System (PFS) | Nikon | hardware-based autofocus system | |
CFI Plan Apo Lambda 20x objective | Nikon | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module | Nikon | This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol | |
ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g | |||
RStudio Version 1.0.44 | Rstudio | ||
R version 3.3.2 |