JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biology

Cellular Redox Profiling ved hjælp af højindholdsmikroskopi

Published: May 14, 2017
doi:
10.3791/55449
, , , ,
1Laboratory of Cell Biology and Histology, Department of Veterinary Sciences,University of Antwerp, 2Cell Systems and Imaging Research Group (CSI), Department of Molecular Biotechnology,Ghent University, 3Department of Biochemistry , Radboud Institute for Molecular Life Sciences,Radboud University Medical Center

Summary

I dette papir præsenteres en mikroskopisk arbejdsstrøm med høj indhold til samtidig kvantificering af intracellulære ROS-niveauer samt mitokondrielt membranpotentiale og morfologi – i fællesskab betegnet mitokondriel morfofunktion – i levende adhærente celler ved anvendelse af de cellemeorante fluorescerende reportermolekyler 5- (og- 6) -chloromethyl-2 ', 7'-dichlorodihydrofluoresceindiacetat, acetylester (CM-H2 DCFDA) og tetramethylrhodaminmethylester (TMRM).

Abstract

Reaktive oxygenarter (ROS) regulerer væsentlige cellulære processer, herunder genekspression, migration, differentiering og proliferation. Overdrivne ROS-niveauer fremkalder imidlertid en tilstand af oxidativ stress, som ledsages af irreversibel oxidativ skade på DNA, lipider og proteiner. Således giver kvantificering af ROS en direkte proxy for cellulær sundhedstilstand. Da mitokondrier er blandt de store cellulære kilder og mål for ROS, er fælles analyse af mitochondrielle funktion og ROS-produktion i de samme celler afgørende for bedre at forstå sammenkoblingen i patofysiologiske forhold. Derfor blev en højmikroskopibaseret strategi udviklet til samtidig kvantificering af intracellulære ROS-niveauer, mitokondrielt membranpotentiale (ΔΨ m ) og mitokondrielmorfologi. Den er baseret på automatiseret widefield fluorescensmikroskopi og billedanalyse af levende vedhæftende celler, der vokser i plader med flere brønde og staineD med de celle-permeable fluorescerende reportermolekyler CM-H2 DCFDA (ROS) og TMRM (ΔΨm og mitokondrielmorfologi). I modsætning til fluorimetri eller flowcytometri tillader denne strategi kvantificering af subcellulære parametre på niveauet af den enkelte celle med høj spatiotemporal opløsning, både før og efter forsøgsstimulering. Det er vigtigt, at den billedbaserede natur af metoden tillader ekstraktion af morfologiske parametre ud over signalintensiteter. Det kombinerede funktionssæt bruges til eksplorativ og statistisk multivariat dataanalyse til at detektere forskelle mellem subpopulationer, celletyper og / eller behandlinger. Her gives en detaljeret beskrivelse af analysen sammen med et eksempeleksperiment, der viser dets potentiale for entydig forskelsbehandling mellem cellulære tilstande efter kemisk forstyrrelse.

Introduction

Koncentrationen af ​​intracellulær ROS reguleres omhyggeligt gennem et dynamisk samspil mellem ROS-producerende og ROS-defusionssystemer. Ubalance mellem de to fremkalder en tilstand af oxidativ stress. Blandt de vigtigste kilder til ROS er mitokondrier 1 . På grund af deres rolle i cellulær respiration er de ansvarlige for størstedelen af ​​intracellulære superoxid (O 2 • – ) molekyler 2 . Dette skyldes for det meste elektrondækage til O2 i kompleks 1 af elektrontransportkæden under betingelser med stærkt negativt indre mitokondrialmembranpotentiale (ψψ m ), dvs. mitokondriel hyperpolarisering. På den anden side er mitokondrielt depolarisering også korreleret med øget ROS-produktion, der peger på flere virkemåder 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 . Endvidere korrigerer ROS ved hjælp af redoxmodifikationer i proteiner fra fissionsfusionsmaskineriet mitokondriemorfologi 9. For eksempel er fragmentering korreleret med øget ROS-produktion og apoptose 10 , 11 , mens filamentøse mitokondrier er blevet forbundet med næringsstult og beskyttelse mod Mitofagi 12 . I betragtning af det indviklede forhold mellem cellulær ROS og mitokondrialt morfofunktion, bør begge ideelt set kvantificeres samtidigt i levende celler. For at gøre netop dette blev der udviklet et billeddannelsesassay med høj indhold baseret på automatiseret widefieldmikroskopi og billedanalyse af adherente cellekulturer farvet med fluorescerende prober CM-H 2 DCFDA (ROS) og TMRM (mitokondriel Δψ m og morfologi). Højindhold billeddannelse refererer til udvinding af spAtiotemporalt rige ( dvs. stort antal beskrivende egenskaber) information om cellulære fænotyper ved hjælp af flere komplementære markører og automatiserede billedanalyser. Når de kombineres med automatiseret mikroskopi, kan mange prøver screenes parallelt ( dvs. høj gennemstrømning) og derved øge analysens statistiske effekt. Faktisk er et primært aktiv i protokollen, at det giver mulighed for samtidig kvantificering af flere parametre i samme celle, og dette for et stort antal celler og betingelser.

Protokollen er opdelt i 8 dele (beskrevet detaljeret i protokollen nedenfor): 1) Seedceller i en 96-brønds plade; 2) Fremstilling af stamopløsninger, arbejdsløsninger og billeddannelsesbuffer; 3) Opsætning af mikroskop; 4) Indlæsning af cellerne med CM-H2 DCFDA og TMRM; 5) Første levende billeddannelsesrunde til måling af basale ROS niveauer og mitokondriel morphofunktion; 6) Anden levende billeddannelsesrunde efter tilsætning af tert -butylPeroxid (TBHP) til måling af inducerede ROS-niveauer; 7) Automatiseret billedanalyse; 8) Dataanalyse, kvalitetskontrol og visualisering.

Assayet blev oprindeligt udviklet til normale humane dermal fibroblaster (NHDF). Da disse celler er store og flade, er de velegnede til vurdering af mitokondriamorfologi i 2D widefield-billeder 13 , 14 . Men med mindre ændringer er denne metode gældende for andre vedhængende celletyper. Desuden er arbejdsflowet ved siden af ​​kombinationen af ​​CM-H 2 DCFDA og TMRM i overensstemmelse med en række fluorescerende farvestofpar med forskellige molekylære specificiteter 1 , 15 .

Protocol

Protokollen nedenfor beskrives som udført for NHDF-celler og ved anvendelse af multiwellpladerne, der er angivet i materialefilen. Se Figur 1 for et generelt overblik over arbejdsgangen. 1. Fremstilling af reagenser Forbered komplet medium ved at supplere Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% v / v føtalt bovint serum (FBS) og 100 IE / ml penicillin og 100 IE / ml streptomycin (PS). Til 500 ml komplet medium tilsættes 50 ml FBS og 5 m…

Representative Results

Assayet er blevet benchmarked ved anvendelse af adskillige kontrolforsøg, hvis resultater er beskrevet i Sieprath et al. 1 . Kort fortalt er fluorescensresponsen af ​​CM-H2 DCFDA og TMRM til extrant inducerede ændringer i intracellulær ROS og Δψm blevet kvantificeret til bestemmelse af det dynamiske område. For CM-H2 DCFDA viste NHDF en lineær stigning i fluorescenssignalet, når det blev behandlet med stigende koncentrationer af TBHP mellem et…

Discussion

I dette papir beskrives en højindholdsmikroskopimetode til samtidig kvantificering af intracellulære ROS-niveauer og mitokondriel morfofunktion i NHDF. Dens præstation blev demonstreret ved en casestudie om SQV-behandlet NHDF. Resultaterne understøtter tidligere beviser fra litteratur, hvor der er observeret forhøjede ROS-niveauer eller mitokondrielle dysfunktion efter behandling med HIV-proteasehæmmere af type 1, om end i separate forsøg 19 , 20 ,</…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was supported by the University of Antwerp (TTBOF/29267, TTBOF/30112), the Special Research Fund of Ghent University (project BOF/11267/09), NB-Photonics (Project code 01-MR0110) and the CSBR (Centers for Systems Biology Research) initiative from the Netherlands Organization for Scientific Research (NWO; No: CSBR09/013V). Parts of this manuscript have been adapted from another publication1, with permission of Springer. The authors thank Geert Meesen for his help with the widefield microscope.

Materials

Reagents
Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) ThermoFisher Scientific T668
CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) ThermoFisher Scientific C6827
Dimethyl sulfoxide Sigma)Aldrich D8418
MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded Brooks life science systems MGB096-1-2-LG-L
HBSS w/o Phenol Red 500 ml Lonza BE10-527F
DMEM high glucose with L-glutamine Lonza BE12-604F
Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg Lonza BE17-516F
HEPES 1M 500mL Lonza 17-737F
Trypsin-Versene (EDTA) Solution Lonza BE17-161E
Cy3 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson 711-166-152 Antibody used for acquiring flat-field image
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson 711-546-152 Antibody used for acquiring flat-field image
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Nikon Ti eclipse widefield microscope Nikon
Perfect Focus System (PFS) Nikon hardware-based autofocus system
CFI Plan Apo Lambda 20x objective Nikon
Name Company Catalog Number Comments
Software
NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module Nikon This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol
ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g
RStudio Version 1.0.44 Rstudio
R version 3.3.2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction. AAEC. 219, 149-177 (2016).
  2. Marchi, S., et al. Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging). J Signal Transduct. 2012, 1-17 (2012).
  3. Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).
  4. Miwa, S., Brand, M. D. Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling. Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).
  5. Verkaart, S., et al. Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency. BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).
  6. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).
  7. Lebiedzinska, M., et al. Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders. BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).
  8. Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
  9. Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics. Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).
  10. Koopman, W. J. H., et al. Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology?. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).
  11. Archer, S. L. Mitochondrial dynamics–mitochondrial fission and fusion in human diseases. N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).
  12. Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).
  13. Koopman, W. J. H., et al. Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 ",7 -"dichlorofluorescein. Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).
  14. Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy. Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).
  15. Sieprath, T., et al. Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates. Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).
  16. Zuiderveld, K. Contrast limited adaptive histogram equalization. Graphics gems IV. , 474-485 (1994).
  17. Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. . shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2. , (2017).
  18. Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals. J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).
  19. Estaquier, J., et al. Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death. J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).
  20. Matarrese, P., et al. Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors. J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).
  21. Roumier, T., et al. HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis. Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).
  22. Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone. Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).
  23. Touzet, O., Philips, A. Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation. AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).
  24. Bociąga-Jasik, M., et al. Metabolic effects of the HIV protease inhibitor–saquinavir in differentiating human preadipocytes. Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).
  25. Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway. Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).
  26. Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning. Sci. Rep. 5, 8035 (2015).
  27. . Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf (2006)
  28. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
  29. Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy. Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).
  30. Deutsch, M., Deutsch, A., et al. A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells. Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).
  31. Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O’Toole, P. J., Smith, D. F. Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging. Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).
  32. Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension. JBO. 18 (12), (2013).
  33. Fercher, A., O’Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells. Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).
  34. Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).
  35. Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. 3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy. Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).
  36. Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity. Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).
  37. Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays. Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).
  38. Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).

Tags

Cellular Redox ProfilingHigh-content MicroscopyMitochondrial MorphofunctionReactive Oxygen SpeciesRedox FingerprintOxidative StressHuman Dermal FibroblastsCM-H2DCFDATMRMMulti-well PlateMicroscope SetupImaging ProtocolWell Plate AlignmentSequential Wavelength Acquisition
check_url/55449?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sieprath, T., Corne, T., Robijns, J., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e55449, doi:10.3791/55449 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image