تقييم Cardiomyocyte الأنواع الفرعية بعد إعادة برمجة بوساطة عامل النسخ من الفأر الجنينية الخلايا الليفية
Summary
This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.
Abstract
Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs).
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.
Introduction
والقلب هو أول جهاز وظيفي لتطوير في الجنين 1 و 2. بالتزامن مع الدورة الدموية، فإنه يوفر الأوكسجين والمغذيات، وآلية التخلص من النفايات خلال التنمية. بعد ثلاثة أسابيع من الإخصاب، وقلب الإنسان يدق للمرة الأولى، ويتم الحفاظ على التنظيم الصحيح من قبل العضلية (CMS). وبالتالي فإن خسارة لا رجعة فيها هذه الخلايا المتخصصة هي القضية الأساسية الكامنة وراء فشل القلب التدريجي. في حين أن بعض الكائنات الحية مثل الزرد والقيطم لديها القدرة على التجدد القلب، الكبار قلب الثدييات أكثر محدودية 3 و 5 و 6. وهكذا، وبالنظر إلى وظيفة حرجة من القلب، فإنه ليس من المدهش أن أمراض القلب هي السبب الرئيسي للوفاة في العالم، وهو ما يمثل 600،000 حالة وفاة في الولايات المتحدة وحدها 7. الrefore، العلاجات المستندة إلى الخلايا لإصلاح أو استبدال عضلة القلب جرح بكفاءة ذات الفائدة السريرية كبيرة.
وأظهرت الدراسة المنوية من ياماناكا وزملاؤه 8 هذا التعبير القسري لأربعة عوامل النسخ غير كافية لتحويل الخلايا الليفية متباينة تماما الخلايا الجذعية المحفزة. ومع ذلك، فإن قدرة مكون للأورام من جميع الاستراتيجيات الخلايا الجذعية المحفزة مصدر قلق بالغ في استخدامها لأغراض علاجية. هذا الدافع المجال العلمي للبحث عن طرق بديلة لتحورها الخلايا مع تجنب مرحلة المحفزة. في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت عدة مجموعات جدوى هذه الاستراتيجية من خلال عرض التحويل المباشر من الخلايا الليفية الماوس لالناجم عن خلايا تشبه cardiomyocyte (iCLMs) مع التعبير خارج الرحم من عوامل النسخ Gata4، Mef2c، Tbx5، وفي وقت لاحق، Hand2 (GMT وGHMT ، على التوالي) 9، 10. Furthermore، نفس الاستراتيجية لا يمكن أن يؤديها في الجسم الحي وفي الأنسجة المستمدة الإنسان 9 و 11 و 12. وقد أبرزت الدراسات الحديثة عوامل إضافية أو مسارات الإشارات التي يمكن التضمين لزيادة تحسين كفاءة إعادة برمجة القلب 13 و 14 و 15. أخذت معا، هذه الدراسات توضح إمكانات transdifferentiation موجهة لعلاجات التجدد. ومع ذلك، فإن انخفاض كفاءة CM برمجة، الآليات الجزيئية غير معروفة، واستنساخ يتعارض بسبب الاختلافات المنهجية 16، وطبيعة متجانسة من iCLMs تظل دون معالجة.
من أجل تقييم مباشرة iCLM عدم التجانس، قمنا بتصميم فحص وحيدة الخلية منفصلة وقوية للتعرف على تطوير قسيم عضلي والقلب specificatio النسبالخصائص اللازمة العضلية وظيفية اثنين ن. هناك على الأقل ثلاثة أنواع رئيسية من CM في قلب كما هو محدد حسب الموقع والخصائص الكهربائية فريدة من نوعها: الأذيني (AM)، البطين (VM) وجهاز تنظيم ضربات القلب (بعد الظهر) 17، 18، 19، 20. في مزيج مدبرة، فهي تسمح ضخ السليم من الدم. أثناء إصابة القلب، قد تتأثر واحد أو كل أنواع فرعية، وسيكون نوع من العلاج بالخلايا تحتاج إلى أن تعالج على أساس كل حالة على حدة. حاليا، تركز معظم الاستراتيجيات على الجيل العام للالعضلية، في حين يجري القيام به القليل من العمل لدراسة الآليات الجزيئية التي تنظم مواصفات النوع الفرعي.
تفاصيل الدراسة التالية كيفية قياس صحيح ساركومير منظمة تنظيما جيدا وتحديد مجموعة متنوعة من أنواع فرعية cardiomyocyte. باستخدام جهاز تنظيم ضربات القلب (PM) -specific الماوس المراسل، ونحن قادرون على تطبيق طنهج mmunocytochemical للتمييز الناجم عن myocytes مثل الأذيني (IAM)، الناجم عن myocytes مثل البطين (IVM)، والتي يسببها myocytes PM تشبه (مراقبي الشرطة الدوليين) 21. وبناء على ملاحظاتنا، فقط الخلايا التي تظهر منظمة قسيم عضلي قادرة على الضرب من تلقاء أنفسهم. هذه المنصة إعادة برمجة فريدة من نوعها تسمح لتقييم دور بعض المعلمات في منظمة قسيم عضلي، مواصفات النوع الفرعي، وكفاءة إعادة برمجة سم في قرار وحيد الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتقدم هذه الدراسة استراتيجية لإعادة برمجة مباشرة لتحويل MEFS إلى مجموعة متنوعة من أنواع فرعية في القلب عن طريق التعبير بوساطة الارتجاعي من النسخ القلب العوامل Gata4، Mef2c، Tbx5، وHand2 (GHMT). باستخدام نهج المناعية تعدد الإرسال في توليفة مع الماوس مراسل PM محددة، ونحن قادرون على ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.F.-P. was supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship under Grant No.2015165336. N.V.M was supported by grants from the NIH (HL094699), Burroughs Wellcome Fund (1009838), and the March of Dimes (#5-FY14-203). We acknowledge Young-Jae Nam, Christina Lubczyk, and Minoti Bhakta for their important contributions to protocol development and data analysis. We also thank John Shelton for valuable technical input and members of the Munshi lab for scientific discussion.
Materials
| DMEM | Sigma | D5796 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Component of iCLM media |
| Fetal bovine serrum (FBS) | Sigma | F2442 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | Component of iCLM media |
| MEM vitamin solution | Thermo Fisher Scientific | 11120-052 | Component of iCLM media |
| MEM amino acids | Thermo Fisher Scientific | 1601149 | Component of iCLM media |
| Non-Essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | Component of iCLM media |
| Antibiotic-Antimycotics | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Component of iCLM media |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Component of iCLM media |
| Heat-Inactivated Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | Component of iCLM media |
| NaPyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-70 | Component of iCLM media |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 1514022 | Component of Plat-E media and fibroblast media |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A11139-03 | Component of Plat-E media |
| Blasticidin | Gemini Bio-Products | 400-128P | Component of Plat-E media |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Component of Fibroblast media |
| Confocal laser scanning LSM700 | Zeiss | For confocal analysis | |
| FuGENE 6 transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-070 | Transfection reagent |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Induction reagent. Use at a final concentration of 8um/mL |
| Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic | CellBiolabs | RV-101 | Retroviral pacaking cell line |
| Trypsin 0.25% EDTA | Thermo Fisher Scientific | For MEFs and Plat-E dissociation | |
| Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53) | Sigma | A7811 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Chicken anti-GFP IgY | Thermo Fisher Scientific | A10262 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Rabbit Pab anti-NPPA | Abgent | AP8534A | Antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Rabbit Pab anti Myl2 IgG | ProteinTech | 10906-1-AP | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Vector Labs | H-1500 | Dye for confocal analysis |
| Superfrost Plus Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-15 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| BioCoat Fibronectin 12mm coverslips | NeuVitro Corp | GG-12-1.5 | Coverslips for confocal analysis |
| 100um cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 0.45um Syringes filters SFCA 25MM | Thermo Fisher Scientific | 09-740-106 | For virus filtration |
| 6ml Syringes | Covidien | 8881516937 | For virus filtration |
| Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488 | Abcam | AB150169 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L) | Thermo Fisher Scientific | A31573 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Goat anti-mouse IgG(H+L) A555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Triton X-100 | Sigma | 93443-100ml | For cell permeabilization |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS) | Sigma | D8537 | |
| Power Block 10X Universal Blocking reagent | Thermo Fisher Scientific | NC9495720 | Dilute to 1X in H20 |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) | Electro Microscopy Sciences | 15710 | Use at 4% diluted in dH20 |
| 6 cm plates | Olympus | 25-260 | |
| 6-well plates | Genesee Scientific | 25-105 | |
| 24-well plates | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Corning | 4239 | |
| 15 cm Tissue culture dishes | Thermo Fisher Scientific | 5442 | |
| 15 ml Conical tubes | Corning | 4308 | |
| 50 ml Conical tubes | Corning | 4249 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma | T8154 | For viability |
| Ethyl Alcohol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | 7005 | |
| Bleach | Thermo Fisher Scientific | 6009 |
References
- Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).
- Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231 (2014).
- Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
- Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
- Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nat Commun. 6, 8243 (2015).
- Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application. Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).
- Atkinson, A., et al. Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks. J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).
- Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L. Atrial cardiomyocyte calcium signalling. Biochim Biophys Acta. 1813 (5), 922-934 (2011).
- Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. Establishment of the mouse ventricular conduction system. Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).
- Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Conner, D. A. . Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Ichim, C. V., Wells, R. A. Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation. J Transl Med. 9, 137 (2011).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nat Commun. 5, 5807 (2014).
- Muraoka, N., Ieda, M. Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis. Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E., Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
- Bass, G. T., et al. Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).
