Fare embriyonik fibroblastlar transkripsiyon faktör aracılı yeniden programlanması sonra kardiyomiyosit alt tiplerini değerlendirilmesi
Summary
This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.
Abstract
Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs).
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.
Introduction
Kalp embriyo 1, 2 geliştirmek için ilk fonksiyonel bir organdır. dolaşım sistemi ile birlikte, bu oksijen, besin ve geliştirme sırasında bir atık bertaraf mekanizması sağlamaktadır. Üç hafta döllenmeden sonra, insan kalbi ilk kez yener ve onun uygun düzenleme kardiyomiyositlerde (CMS) tarafından yapılmaktadır. Bu özel hücrelerin geri dönüşümsüz kaybı dolayısıyla ilerici kalp yetmezliği altında yatan temel bir konudur. Böyle Zebra balığı ve Xenopus gibi bazı organizmaların kalp rejenerasyon potansiyeli varken, yetişkin memeli kalp 3, 5, 6 daha sınırlıdır. Böylece, kalbin kritik işlevi göz önüne alındığında, kalp hastalığı tek başına 7 Amerika Birleşik Devletleri'nde 600.000 ölüm için muhasebe, dünyada önde gelen ölüm nedeni olduğunu şaşırtıcı değildir.verimli tamir veya yaralı miyokard yerine refore, hücre bazlı terapiler büyük bir klinik öneme sahiptir.
Yamanaka ve arkadaşları 8 seminal Çalışma dört transkripsiyon faktörlerinin zorla ifade pluripotent kök hücreleri tamamen farklılaşmış fibroblast hücrelerini dönüştürmek için yeterli olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, tüm pluripotent kök hücre stratejilerinin tümörijenik kapasitesi terapötik amaçlar için kullanımı ile önemli bir sorun olmuştur. Bu bir pluripotent sahne kaçınarak alternatif yöntemler hücrelerin transdifferentiate için aramak için bilimsel alanını motive etti. Son zamanlarda, çeşitli gruplar transkripsiyon ektopik ifadesi ile uyarılan kardiyomiyosit-benzeri hücreler (iCLMs) fare fibroblast doğrudan dönüşüm göstererek bu stratejinin uygulanabilirliğini göstermiştir Gata4, Mef2c Tbx5 ve daha sonra, Hand2 (GMT ve GHMT faktörleri sırasıyla) 9, 10. furthermore aynı strateji, in vivo olarak, insan-türevi doku 9, 11, 12 gerçekleştirilebilir. Son çalışmalar, ek faktörler ya da daha fazla kalp yeniden programlama verim 13, 14, 15 geliştirmek için modüle edilebilir yolakları sermiştir. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar rejeneratif tedaviler için yönlendirilmiş transdiferansiyonun potansiyelini göstermektedir. Ancak, metodolojik farklılıklara 16 CM yeniden programlama, bilinmeyen moleküler mekanizmaları, tutarsız tekrarlanabilirlik düşük verimlilik ve iCLMs heterojen yapısı adressiz kalır.
şirketinden iCLM heterojen değerlendirmek için biz sarkomer gelişimi ve kardiyak nesilli Specificatio tanımlanması için ayrı ve sağlam tek hücreli deneyi tasarlanmıştırN-iki fonksiyonel kardiyomiyositlerde gerekli özellikleri. Atriyal (AM), ventriküler (VM) ve kalp pili (PM) 17, 18, 19, 20: konumlarını ve eşsiz elektriksel özellikleri ile tanımlanan kalbinde CM en az üç ana tipi vardır. Bir orkestra birlikte, onlar kan düzgün pompalama sağlar. Kalp yaralanması sırasında, bir veya tüm alt tipleri etkilenebilir ve hücre tedavisi tip bir vaka ile ayrı ayrı ele alınması gerekir. az iş alt tipi özellikleri düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için yapılırken Şu anda, en stratejileri, kardiyomiyositlerinin genel nesil odaklanmak.
Aşağıdaki çalışma düzgün iyi organize sarkomer ölçmek kardiyomyosit alt tiplerinin çeşitli bir dizi tanımlamak için nasıl ayrıntıları. Kalp pili (PM) 'e özgü muhabir Fareyi kullanarak, biz bir i uygulamak mümkünmmunocytochemical yaklaşım kaynaklı atriyal benzeri miyositleri (IAM), uyarılmış ventriküler benzeri miyositleri (IVM) ve uyarılmış PM benzeri miyositleri (IPMS) 21 ayırt etmek. Bizim gözlemlere dayanarak sadece sarkomer organizasyonu sergileyen hücreler spontan dayak yeteneğine sahiptirler. Bu eşsiz yeniden programlama platformu rolünü değerlendirmek için izin verir tek hücreli çözünürlükte sarkomer organizasyonu, alt tip şartname ve CM yeniden programlama verimliliği belli parametreleri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada kardiyak transkripsiyon retrovirüs aracılı ifade yoluyla kardiyak alt tiplerinin farklı setine MEFS dönüşüm için doğrudan yeniden programlama strateji sağlar Gata4, Mef2c Tbx5 ve Hand2 (GHMT) faktörleri. Bir PM özgü muhabiri fare ile birlikte bir multipleks immün yaklaşımı kullanarak, biz tek bir hücre çözünürlükte IAM, IVMS ve IPMS tespit edebiliyoruz. Böyle bir tahlil alt tip çeşitlilik ve sarkomer geliştirilmesine yönelik bireysel transkripsiyon faktörlerinin katkıları …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.F.-P. was supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship under Grant No.2015165336. N.V.M was supported by grants from the NIH (HL094699), Burroughs Wellcome Fund (1009838), and the March of Dimes (#5-FY14-203). We acknowledge Young-Jae Nam, Christina Lubczyk, and Minoti Bhakta for their important contributions to protocol development and data analysis. We also thank John Shelton for valuable technical input and members of the Munshi lab for scientific discussion.
Materials
| DMEM | Sigma | D5796 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Component of iCLM media |
| Fetal bovine serrum (FBS) | Sigma | F2442 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | Component of iCLM media |
| MEM vitamin solution | Thermo Fisher Scientific | 11120-052 | Component of iCLM media |
| MEM amino acids | Thermo Fisher Scientific | 1601149 | Component of iCLM media |
| Non-Essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | Component of iCLM media |
| Antibiotic-Antimycotics | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Component of iCLM media |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Component of iCLM media |
| Heat-Inactivated Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | Component of iCLM media |
| NaPyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-70 | Component of iCLM media |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 1514022 | Component of Plat-E media and fibroblast media |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A11139-03 | Component of Plat-E media |
| Blasticidin | Gemini Bio-Products | 400-128P | Component of Plat-E media |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Component of Fibroblast media |
| Confocal laser scanning LSM700 | Zeiss | For confocal analysis | |
| FuGENE 6 transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-070 | Transfection reagent |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Induction reagent. Use at a final concentration of 8um/mL |
| Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic | CellBiolabs | RV-101 | Retroviral pacaking cell line |
| Trypsin 0.25% EDTA | Thermo Fisher Scientific | For MEFs and Plat-E dissociation | |
| Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53) | Sigma | A7811 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Chicken anti-GFP IgY | Thermo Fisher Scientific | A10262 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Rabbit Pab anti-NPPA | Abgent | AP8534A | Antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Rabbit Pab anti Myl2 IgG | ProteinTech | 10906-1-AP | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Vector Labs | H-1500 | Dye for confocal analysis |
| Superfrost Plus Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-15 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| BioCoat Fibronectin 12mm coverslips | NeuVitro Corp | GG-12-1.5 | Coverslips for confocal analysis |
| 100um cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 0.45um Syringes filters SFCA 25MM | Thermo Fisher Scientific | 09-740-106 | For virus filtration |
| 6ml Syringes | Covidien | 8881516937 | For virus filtration |
| Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488 | Abcam | AB150169 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L) | Thermo Fisher Scientific | A31573 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Goat anti-mouse IgG(H+L) A555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Triton X-100 | Sigma | 93443-100ml | For cell permeabilization |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS) | Sigma | D8537 | |
| Power Block 10X Universal Blocking reagent | Thermo Fisher Scientific | NC9495720 | Dilute to 1X in H20 |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) | Electro Microscopy Sciences | 15710 | Use at 4% diluted in dH20 |
| 6 cm plates | Olympus | 25-260 | |
| 6-well plates | Genesee Scientific | 25-105 | |
| 24-well plates | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Corning | 4239 | |
| 15 cm Tissue culture dishes | Thermo Fisher Scientific | 5442 | |
| 15 ml Conical tubes | Corning | 4308 | |
| 50 ml Conical tubes | Corning | 4249 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma | T8154 | For viability |
| Ethyl Alcohol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | 7005 | |
| Bleach | Thermo Fisher Scientific | 6009 |
References
- Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).
- Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231 (2014).
- Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
- Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
- Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nat Commun. 6, 8243 (2015).
- Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application. Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).
- Atkinson, A., et al. Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks. J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).
- Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L. Atrial cardiomyocyte calcium signalling. Biochim Biophys Acta. 1813 (5), 922-934 (2011).
- Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. Establishment of the mouse ventricular conduction system. Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).
- Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Conner, D. A. . Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Ichim, C. V., Wells, R. A. Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation. J Transl Med. 9, 137 (2011).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nat Commun. 5, 5807 (2014).
- Muraoka, N., Ieda, M. Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis. Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E., Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
- Bass, G. T., et al. Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).
