Konformationel fleksibilitet spiller en afgørende rolle i protein funktion. Heri, beskriver vi anvendelsen af tidsopløst elektrospray massespektrometri koblet til hydrogen-deuterium gengæld for probing de hurtige strukturændringer, som driver funktion i ordnede og uordnede proteiner.
Intrinsisk uordnede proteiner (IDP) har længe været en udfordring at strukturelle biologer på grund af deres mangel på stabile sekundære strukturelementer. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) målt ved hurtige tidsskalaer er unikt egnet til at detektere strukturer og hydrogenbindende netværk, der er kort befolkede, hvilket muliggør karakteriseringen af forbigående konformere i native ensembler. Kobling af HDX til massespektrometri tilbyder flere vigtige fordele, herunder høj følsomhed, lavt prøve og ingen begrænsning på protein størrelse. Denne teknik har avancerede kraftigt i de sidste mange årtier, herunder evnen til at overvåge HDX mærkningsordninger gange på millisekund tidsskala. Desuden ved at inkorporere HDX arbejdsgang på en mikrofluid platform huser en sur protease mikroreaktor, er vi i stand til at lokalisere dynamiske egenskaber på peptidet niveau. I denne undersøgelse, tidsopløst elektrosprayionisering massespektrometri (Tresi-MS) koblet til HDX was bruges til at give et detaljeret billede af tilbageværende struktur i tau-protein, såvel som de konformationelle forskydninger induceret ved hyperphosphorylering.
I de sidste adskillige årtier har betydelige fremskridt er gjort i udvikling af analytiske metoder, der skal måle proteinstruktur og dynamik 1, 2, 3, 4. Mens røntgenkrystallografi forbliver princippet værktøj til bestemmelse proteinstruktur der høje koncentrationer af protein nødvendig og omfattende optimering er nødvendig for at fremstille krystaller af diffraktionskvalitet. Proteiner, som er vanskelige at krystallisere, såsom membranassocierede og uløseligt uordnede proteiner er klassisk blevet undersøgt af hydrogen-deuterium udveksling (HDX) NMR 5. Men i de seneste årtier, kobling af elektrospray-massespektrometri (ESI-MS) til HDX har hurtigt vundet popularitet 6, 7.
Massespektrometri tilbyder en løsningtil mange af de begrænsninger, der er forbundet med røntgenkrystallografi og NMR. Især MS er meget følsom (nM til uM nødvendige koncentrationer), og der er næsten ingen grænse for protein størrelse. Desuden høj arbejdscyklus på MS-analyse giver mulighed for at studere proteiner som de undergår enzymatisk omsætning, misfoldning, kompleksdannelse og andre biologisk relevante processer. Disse processer opstår ofte på millisekund til anden tidsskala og kræver hurtig blanding af reagenser inden analyse.
Udviklingen af tidsopløst elektrosprayionisering (Tresi) af Wilson og Konermann i 2003 tilladt reaktioner, der skal overvåges i pseudo-realtid ved ESI-MS. Deres setup inkorporeret en kapillær mixer med en kontinuerligt regulerbar reaktion kammervolumen 8. Anordningen består af to koncentriske kapillærer, med den indre kapillar forseglet og et hak skåret i siden for at muliggøre blanding inden for det snævre inter-kapillary plads fra indhakket til enden af den indre kapillar (typisk 2 mm). Ved påføring på HDX eksperimenter, den indre kapillar bærer proteinet af interesse, den ydre kapillar bærer mærkningen D2O opløsning, som derefter undergår blanding med proteinet før indtastning justerbare reaktionskammer tillader HDX mærkning forud for direkte overførsel til ESI kilde.
Kort fortalt HDX afhængig af backbone amide hydrogener undergår udveksling med deuteriumatomer i opløsning 9, 10. Udvekslingen er basekatalyseret ved fysiologisk pH, med syre-katalyse bliver fremherskende ved pH under ca. 2,6. Den vekselkurs er baseret på fire hovedfaktorer: pH, temperatur, opløsningsmiddel tilgængelighed og intramolekylær hydrogenbinding. Som de tidligere to forhold holdes konstant under hele forsøget, den vekselkurs, især ved peptidskeletmodifikationer amid stillinger, primært dependent på proteinstruktur 11. Stramt foldet regioner med omfattende, stabile hydrogenbindende netværk i a-helixer og p-sheets vil tage op deuterium ved væsentligt langsommere hastigheder sammenlignet med løkker og uordnede områder (og undertiden slet ikke) 12. Dette giver mulighed for global proteinanalyse, hvor forstyrrelser i struktur (f.eks., Upon aggregering eller substratbinding) medføre afvigende deuterium optagelse (figur 1).
Den kinetiske kapillære mixer kan inkorporeres i en mikrofluid platform med et proteolytisk kammer til lokalisering af deuterium-optagelse. Denne proteolytiske kammer holdes ved lav pH for effektivt standse udskiftningsreaktion, og kræver en immobiliseret sur protease for at fordøje proteinet i lokaliserede peptider (figur 2). Overvågning rygrad udveksling på millisekund til anden tidsskalaer er især vigtigt for dekarakterisering af konformationsændringer inden vanskeligt at karakterisere sløjferegioner, smeltede kugler og uløseligt uordnede proteiner (IDP) 13, 14. Alternativt kan Tresi-HDX også anvendes til at karakterisere proteiner, som i øjeblikket ikke har en løst atomare struktur gennem fremgangsmåderne ifølge røntgenkrystallografi og NMR under anvendelse af deuterium udveksling koblet til Corex algoritme (DX-Corex) tilgang 15, 16. Denne detaljerede protokol vil gælde Tresi-HDX at studere tau, en IDP, i både det oprindelige form såvel som det er patogene hyperphosphoryleret tilstand. Mens indfødte tau er en af de mest godt studerede internt fordrevne, der er lidt kendt om dens amyloidogent modstykke 13.
Mens strukturelle biologi fremgangsmåder såsom røntgenkrystallografi og NMR er fordelagtige, fordi de giver ekstremt detaljerede strukturer af proteiner, disse billeder er ofte statisk. Karakteriseringen af transiente arter og svagt strukturerede domæner fortsat undvigende når undersøgt ved disse konventionelle fremgangsmåder. Derfor, for at få dynamiske indsigt på disse typer af systemer er det vigtigt at arbejde på hurtige tidsskalaer. Vi har med succes anvendt Tresi-HDX-MS for at få detaljerede indbl…
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge Dr. Markus Zweckstetter for providing the pdb coordinate file for the ‘native’ tau ensemble predicted from his NMR work, with contributed analysis tools provided by Dr. Adnan Sljoka. Funding for this work was provided by the Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC) ENGAGE Grant program.
Poly(methyl methacrylate) or PMMA | Professional Plastics | SACR.250CCP | 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm |
Fused Silica Glass Capillary | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID: 75µm, OD: 150µm |
Metal Capillaries | McMaster-Carr | 28 ga – 89875K97 30 ga – 89875K99 |
|
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing | IDEX | 1477 1548 |
ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16” |
Standard Polymer Tubing Cutter | IDEX | A-327 | for 1/16” and 1/8” OD tubing |
Micro Static Mixing Tee | IDEX | M-540 | for 1/16” OD tubing |
or | |||
Stainless Steel Tee, 0.25mm Bore | Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | for 1/16” OD tubing |
PEEK Tee for 1/16” OD Tubing | IDEX | P-727 | |
10-32 Female to Female Luer | IDEX | P-659 | |
10-32 PEEK Double-Winged Nut | IDEX | F-300 | |
Ferrule for 1/16” OD Tubing | IDEX | F-142 | |
100 Series Rotary Tool | Dremel | F013010001 | |
Cut-Off Discs | Jobmate | 1/64” thickness | |
Stereomaster Digital Zoom Microscope | Fisher Scientific | 12-563-411 | |
Soldering Iron | Mastercraft | 58-6301-2 | |
VersaLaser | Universal Laser | ||
Syringes | Hamilton | 81220 | 500µL capacity |
Syringe Pumps | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
NHS-Activated Agarose | Fisher Scientific | 26196 | |
Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
Deuterium Oxide | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-4 | |
Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
Sodium Phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S671-3 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software/Online Tools | |||
CorelDraw X3 | Corel | ||
Molecular Weight Calculator | Version 6.49 | Open Source MS Tool | |
mMass | Version 5.5.0 | Open Source MS Tool | |
ExPASy FindPept | Swiss Institute of Bioinformatics | ||
SigmaPlot | Systat Software | Version 11.0 | |
PyMOL | Schrödinger | Version 1.5.0.4 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Instruments | |||
QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer | AB SCIEX |