Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica
Summary
flexibilidad conformacional desempeña un papel crítico en la función de la proteína. En este documento, se describe el uso de la espectrometría de masas de ionización por electrospray resuelta en el tiempo junto con el intercambio de hidrógeno-deuterio para sondear los rápidos cambios estructurales que impulsan función en proteínas ordenadas y desordenadas.
Abstract
proteínas intrínsecamente desordenados (PDI) han sido durante mucho tiempo un reto para los biólogos estructurales debido a su falta de elementos de estructura secundaria estables. El hidrógeno-deuterio Exchange (HDX) medida en escalas de tiempo rápidas es especialmente adecuado para detectar estructuras y redes de enlaces de hidrógeno que están pobladas brevemente, lo que permite la caracterización de confórmeros transitorios en conjuntos nativos. El acoplamiento de HDX a espectrometría de masas ofrece varias ventajas clave, incluyendo una alta sensibilidad, bajo consumo de muestra y sin restricción en el tamaño de la proteína. Esta técnica ha avanzado mucho en las últimas décadas, incluyendo la capacidad de supervisar HDX tiempos de etiquetado en la escala de tiempo de milisegundos. Además, mediante la incorporación del flujo de trabajo HDX en una plataforma de microfluidos que aloja un microreactor proteasa ácida, somos capaces de localizar propiedades dinámicas en el nivel de péptido. En este estudio, resuelta en el tiempo de ionización por electrospray espectrometría de masas (tresi-MS) acoplado a HDX was utiliza para proporcionar una imagen detallada de la estructura residual en la proteína tau, así como los cambios conformacionales inducidos en la hiperfosforilación.
Introduction
Durante las últimas décadas, los avances se han hecho importantes en el desarrollo de técnicas analíticas diseñadas para medir la estructura de la proteína y la dinámica de 1, 2, 3, 4. Mientras que la cristalografía de rayos X sigue siendo la herramienta principio para la determinación de la estructura de proteínas, se necesitan altas concentraciones de proteína y se requiere una amplia optimización para producir cristales de calidad de difracción. Las proteínas que son difíciles de cristalizar, tales como proteínas asociadas a la membrana y intrínsecamente desordenadas clásicamente se han estudiado por intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX) RMN 5. Sin embargo, en las últimas décadas, el acoplamiento de ionización por electrospray espectrometría de masas (ESI-MS) para HDX ha ganado rápidamente popularidad 6, 7.
Espectrometría de masas ofrece una solucióna muchas de las restricciones planteados por cristalografía de rayos X y RMN. En particular, MS es altamente sensible (nM a concentraciones mu M se requiere), y prácticamente no hay límite en el tamaño de la proteína. Además, el ciclo de trabajo alto de análisis MS permite la posibilidad de estudiar proteínas que sean sometidos a rotación enzimática, mal plegamiento, formación de complejos y otros procesos biológicamente relevantes. Estos procesos ocurren a menudo en el milisegundo a segunda escala de tiempo y requieren un mezclado rápido de los reactivos antes del análisis.
El desarrollo de resuelta en el tiempo de ionización por electrospray (tresi) por Wilson y Konermann en 2003 reacciones se permite monitorizar en tiempo real mediante la pseudo-ESI-MS. Su configuración incorpora un mezclador capilar con un volumen de cámara de reacción continuamente ajustable 8. El dispositivo consta de dos capilares concéntricos, con el capilar interior sellado y una muesca cortada en su lado para permitir la mezcla dentro de la estrecha inter-capillary el espacio de la muesca en el extremo del capilar interior (típicamente 2 mm). Cuando se aplica a experimentos HDX, el capilar interior lleva la proteína de interés, el capilar exterior lleva el etiquetado D2O solución, que sufre a continuación la mezcla con la proteína antes de entrar en la cámara de reacción ajustable que permite para el etiquetado HDX antes de la transferencia directa en el ESI fuente.
Brevemente, HDX se basa en hidrógenos amida de cadena principal sometidos a intercambio con átomos de deuterio en solución 9, 10. El intercambio es catalizada por bases a pH fisiológico, con ácido-catálisis convertirse en predominante a pH por debajo de aproximadamente 2,6. La tasa de cambio se basa en cuatro factores principales: pH, temperatura, disolvente accesibilidad y de enlace de hidrógeno intramolecular. Como los dos primeros factores se mantienen constantes durante todo el experimento, la tasa de cambio, en particular en las posiciones de amida del esqueleto peptídico, es principalmente dependent en la estructura de proteínas 11. Bien doblado regiones con extensas redes de enlaces de hidrógeno, estables en alfa-hélices y láminas beta se llevará hasta deuterio a velocidades sustancialmente más lento en comparación con los bucles y las regiones desordenadas (y, a veces no en todos) 12. Esto permite el análisis de proteína global, donde las perturbaciones en la estructura (por ejemplo., Sobre la agregación o de unión al sustrato) conducen a diferentes captación de deuterio (Figura 1).
El mezclador capilar cinética puede ser incorporado en una plataforma de microfluidos que contiene una cámara proteolítica para la localización de la captación de deuterio. Esta cámara proteolítica se lleva a cabo a pH bajo con el fin de apagar efectivamente la reacción de intercambio, y requiere una proteasa ácida inmovilizada con el fin de digerir la proteína en péptidos localizados (Figura 2). Supervisión de Exchange columna vertebral en milisegundos a escalas segunda vez es especialmente importante para lacaracterización de cambios conformacionales dentro de difícil caracterizar regiones de bucle, glóbulos fundidos, y proteínas intrínsecamente desordenadas (PDI) 13, 14. Alternativamente, tresi-HDX también se puede utilizar para caracterizar las proteínas que actualmente no tienen una estructura atómica resuelto a través de los métodos de cristalografía de rayos X y RMN, usando intercambio de deuterio acoplado al algoritmo de COREX (DX-COREX) enfoque 15, 16. Este protocolo detallado se aplicará tresi-HDX para estudiar tau, un desplazado interno, tanto en su forma nativa, así como su estado hiperfosforilada patógeno. Mientras que la TAU nativa es una de las PDI más bien estudiado, se sabe poco sobre su contraparte amiloidogénica 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mientras que los métodos de biología estructural, tales como cristalografía de rayos X y RMN son ventajosos porque proporcionan estructuras extremadamente detalladas de proteínas, estas imágenes son a menudo estática. La caracterización de las especies transitorias y dominios débilmente estructurados sigue siendo difícil de alcanzar cuando se estudió por estos métodos convencionales. Por lo tanto, con el fin de obtener una visión dinámica de este tipo de sistemas es importante trabajar a escalas de tiempo r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge Dr. Markus Zweckstetter for providing the pdb coordinate file for the ‘native’ tau ensemble predicted from his NMR work, with contributed analysis tools provided by Dr. Adnan Sljoka. Funding for this work was provided by the Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC) ENGAGE Grant program.
Materials
| Poly(methyl methacrylate) or PMMA | Professional Plastics | SACR.250CCP | 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm |
| Fused Silica Glass Capillary | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID: 75µm, OD: 150µm |
| Metal Capillaries | McMaster-Carr | 28 ga – 89875K97 30 ga – 89875K99 |
|
| Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing | IDEX | 1477 1548 |
ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16” |
| Standard Polymer Tubing Cutter | IDEX | A-327 | for 1/16” and 1/8” OD tubing |
| Micro Static Mixing Tee | IDEX | M-540 | for 1/16” OD tubing |
| or | |||
| Stainless Steel Tee, 0.25mm Bore | Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | for 1/16” OD tubing |
| PEEK Tee for 1/16” OD Tubing | IDEX | P-727 | |
| 10-32 Female to Female Luer | IDEX | P-659 | |
| 10-32 PEEK Double-Winged Nut | IDEX | F-300 | |
| Ferrule for 1/16” OD Tubing | IDEX | F-142 | |
| 100 Series Rotary Tool | Dremel | F013010001 | |
| Cut-Off Discs | Jobmate | 1/64” thickness | |
| Stereomaster Digital Zoom Microscope | Fisher Scientific | 12-563-411 | |
| Soldering Iron | Mastercraft | 58-6301-2 | |
| VersaLaser | Universal Laser | ||
| Syringes | Hamilton | 81220 | 500µL capacity |
| Syringe Pumps | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NHS-Activated Agarose | Fisher Scientific | 26196 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
| Deuterium Oxide | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software/Online Tools | |||
| CorelDraw X3 | Corel | ||
| Molecular Weight Calculator | Version 6.49 | Open Source MS Tool | |
| mMass | Version 5.5.0 | Open Source MS Tool | |
| ExPASy FindPept | Swiss Institute of Bioinformatics | ||
| SigmaPlot | Systat Software | Version 11.0 | |
| PyMOL | Schrödinger | Version 1.5.0.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer | AB SCIEX |
References
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