時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために
Summary
コンフォメーションの柔軟性は、タンパク質の機能に重要な役割を果たしています。本明細書において、我々は、規則及び不規則タンパク質に機能を駆動急速な構造変化をプロービングするための水素 – 重水素交換に結合された時間分解エレクトロスプレーイオン化質量分析法の使用を記載しています。
Abstract
本質的に無秩序なタンパク質（国内避難民）は、長い安定な二次構造要素の欠如のために、構造生物学者への課題となっています。迅速な時間スケールで測定し、水素 – 重水素交換（HDX）を一意に簡単にネイティブアンサンブルにおける一過性配座異性体の特徴付けを可能にする、移入された構造と水素結合ネットワークを検出するために適しています。質量分析にHDXの結合は、高感度、低サンプル消費及びタンパク質サイズには制限を含むいくつかの重要な利点を提供します。この手法は、ミリ秒の時間スケールでHDXラベリング時間を監視する機能など、過去数十年で大幅に進歩しています。また、酸性プロテアーゼマイクロリアクタを収容するマイクロ流体プラットフォームにHDXワークフローを組み込むことによって、我々は、ペプチドレベルでの動的特性を局在化することができます。本研究では、時間分解エレクトロスプレーイオン化質量分析（TRESI-MS）は、HDX WAに結合されSは、タウタンパク質、ならびに過剰リン酸化の際に誘導されるコンフォメーションシフトの残留構造の詳細な画像を提供するために使用されます。
Introduction
過去数十年にわたり、重要な進歩は、タンパク質の構造とダイナミクス1、2、3、4を測定するために設計された分析技術の開発に行われています。 X線結晶学は、タンパク質の構造を決定するための原則ツールまま、タンパク質の高い濃度が必要とされ、大規模な最適化は、回折品質結晶を生成するために必要とされます。このような膜結合と本質的に無秩序なタンパク質として結晶化することが困難であるタンパク質は、古典的水素-重水素交換（HDX）NMR 5によって研究されています。しかし、最近数十年で、HDXにエレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）のカップリングは、急速に人気6、7を得ました。
質量分析は、ソリューションを提供していますX線結晶学およびNMRによってもたらされる制限の多くに。具体的には、MSは、高感度の（必要μM濃度までnm）であり、タンパク質の大きさに制限は事実上存在しません。加えて、MS分析の高デューティサイクルは、それらは、酵素代謝回転、ミスフォールディング、錯体および他の生物学的に関連したプロセスを経るようなタンパク質を研究する可能性を可能にします。これらのプロセスは、多くの場合、第二時間スケールにミリ秒で発生し、分析前に試薬の迅速な混合を必要とします。
2003年にウィルソンとKonermannによって時間分解エレクトロスプレーイオン化（TRESI）の開発は、反応はESI-MSにより擬似リアルタイムで監視することを可能にしました。それらの設定は、連続的に調整可能な反応チャンバ容積8と毛細管ミキサーを組み込みました。デバイスは、狭間capillar内の混合を可能にするために密封され、内側毛細管とその側に切断ノッチを有する2本の同心の毛管から成り内側毛細管（典型的には2 mm）の終了までのノッチからY空間。 HDX実験に適用した場合、内側毛細管は、目的のタンパク質を運び、外側毛管は、次いでESIに先立って直接転写にHDX標識を可能にする調節可能な反応室に入る前にタンパク質と混合受け標識D 2 O溶液を、運びますソース。
簡単に言えば、HDXは、ソリューション9、10で重水素原子との交換を受けた骨格アミド水素に依存しています。交換が塩基触媒生理学的pHで、酸触媒は、約2.6以下のpHで優勢になりつつとなります。 pH、温度、溶媒アクセシビリティおよび分子内水素結合：為替レートは、4つの主な要因に基づいています。前者の二つの要因は実験を通して一定に保たれるように、特にペプチド骨格のアミド位置の交換の速度は、主にdependenありますタンパク質構造11上のトン。 αヘリックスおよびβシートで広範囲、安定した水素結合ネットワークと緊密に折り畳まれた領域は、ループおよび無秩序化領域に比べて実質的に遅い速度で重水素を取り込む（時には全くない）であろう12。これは、構造における摂動（ 例えば 、凝集または基質結合時）は、異なる重水素取り込み（ 図1）に導くグローバルタンパク質分析を可能にします。
運動キャピラリーミキサーは、重水素の取り込みの局在化のためにタンパク質分解チャンバーを含むマイクロ流体プラットフォームに組み込むことができます。このタンパク質分解チャンバを効果的交換反応をクエンチするために、低pHで保持され、ローカライズされたペプチド（ 図2）にタンパク質を消化するために、固定化された酸性プロテアーゼを必要とします。第二の時間スケールにミリ秒で、バックボーン交換を監視するために特に重要ですループ領域を特徴付けることが困難内のコンホメーション変化、溶融小球、及び本質的に無秩序なタンパク質（のIDP）13、14の特徴付け。あるいは、TRESI-HDXは、現在COREXアルゴリズム（DX-COREX）アプローチ15、16に結合された重水素交換を使用して、X線結晶学およびNMRの方法によって解決原子構造を有していないタンパク質を特徴付けるために使用することができます。この詳細なプロトコルは、両方とも、それは天然の形態だだけでなく、それが病原性の過リン酸化状態だで、IDP、タウを研究するためにTRESI-HDXを適用します。ネイティブタウが最もよく研究の国内避難民の一つですが、少しはそのアミロイド形成性対応13について知られています。
Protocol
Representative Results
Discussion
彼らは、タンパク質の非常に詳細な構造を提供するので、このようなX線結晶学およびNMRなどの構造生物学の方法が有利であるが、これらの写真は、多くの場合、静的です。これらの従来の方法により研究する際の過渡種弱構造ドメインの特徴付けは、とらえどころのないことを継続します。したがって、これらのタイプのシステム上の動的な洞察を得るためには、迅速な時間スケールで仕事…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge Dr. Markus Zweckstetter for providing the pdb coordinate file for the ‘native’ tau ensemble predicted from his NMR work, with contributed analysis tools provided by Dr. Adnan Sljoka. Funding for this work was provided by the Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC) ENGAGE Grant program.
Materials
| Poly(methyl methacrylate) or PMMA | Professional Plastics | SACR.250CCP | 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm |
| Fused Silica Glass Capillary | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID: 75µm, OD: 150µm |
| Metal Capillaries | McMaster-Carr | 28 ga – 89875K97 30 ga – 89875K99 |
|
| Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing | IDEX | 1477 1548 |
ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16” |
| Standard Polymer Tubing Cutter | IDEX | A-327 | for 1/16” and 1/8” OD tubing |
| Micro Static Mixing Tee | IDEX | M-540 | for 1/16” OD tubing |
| or | |||
| Stainless Steel Tee, 0.25mm Bore | Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | for 1/16” OD tubing |
| PEEK Tee for 1/16” OD Tubing | IDEX | P-727 | |
| 10-32 Female to Female Luer | IDEX | P-659 | |
| 10-32 PEEK Double-Winged Nut | IDEX | F-300 | |
| Ferrule for 1/16” OD Tubing | IDEX | F-142 | |
| 100 Series Rotary Tool | Dremel | F013010001 | |
| Cut-Off Discs | Jobmate | 1/64” thickness | |
| Stereomaster Digital Zoom Microscope | Fisher Scientific | 12-563-411 | |
| Soldering Iron | Mastercraft | 58-6301-2 | |
| VersaLaser | Universal Laser | ||
| Syringes | Hamilton | 81220 | 500µL capacity |
| Syringe Pumps | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NHS-Activated Agarose | Fisher Scientific | 26196 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
| Deuterium Oxide | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software/Online Tools | |||
| CorelDraw X3 | Corel | ||
| Molecular Weight Calculator | Version 6.49 | Open Source MS Tool | |
| mMass | Version 5.5.0 | Open Source MS Tool | |
| ExPASy FindPept | Swiss Institute of Bioinformatics | ||
| SigmaPlot | Systat Software | Version 11.0 | |
| PyMOL | Schrödinger | Version 1.5.0.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer | AB SCIEX |
References
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