प्रोटीन संरचना और गतिशीलता के अध्ययन के लिए समय का समाधान electrospray ionization हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री
Summary
गठनात्मक लचीलापन प्रोटीन समारोह में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इस के साथ साथ, हम समय-संकल्प लिया electrospray ionization जन त्वरित संरचनात्मक परिवर्तन है कि आदेश दिया और अव्यवस्थित प्रोटीन में समारोह ड्राइव की जांच के लिए हाइड्रोजन ड्यूटेरियम विनिमय के लिए युग्मित स्पेक्ट्रोमेट्री के उपयोग का वर्णन।
Abstract
आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन (आईडीपी) लंबे समय से स्थिर माध्यमिक संरचना तत्वों की कमी की वजह से संरचनात्मक जीव के लिए एक चुनौती की गई है। हाइड्रोजन-Deuterium एक्सचेंज (HDX) तेजी से समय पैमाने पर मापा विशिष्ट संरचनाओं और हाइड्रोजन संबंध नेटवर्क है कि संक्षेप में भर जाती है पता लगाने के लिए, देशी टुकड़ियों में क्षणिक conformers के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता अनुकूल है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए HDX के युग्मन उच्च संवेदनशीलता, कम नमूना खपत और प्रोटीन आकार पर कोई प्रतिबंध सहित कई प्रमुख लाभ, प्रदान करता है। इस तकनीक को पिछले कई दशकों में काफी उन्नत हुई है, मिलीसेकंड समय पैमाने पर HDX लेबलिंग बार पर नजर रखने की क्षमता भी शामिल है। इसके अलावा, एक अम्लीय प्रोटीज microreactor आवास एक microfluidic मंच पर HDX कार्यप्रवाह को शामिल करके, हम पेप्टाइड स्तर पर गतिशील गुण स्थानीय बनाना करने में सक्षम हैं। इस अध्ययन में, समय-समाधान किया electrospray ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री (TRESI-एमएस) HDX वा के लिए युग्मितरों ताऊ प्रोटीन में अवशिष्ट संरचना का एक विस्तृत चित्र, साथ ही गठनात्मक बदलाव hyperphosphorylation पर प्रेरित प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया।
Introduction
पिछले कई दशकों में, महत्वपूर्ण प्रगति प्रोटीन संरचना और गतिशीलता 1, 2, 3, 4 को मापने के लिए तैयार किया गया है विश्लेषणात्मक तकनीकों के विकास में किए गए हैं। एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी प्रोटीन संरचना निर्धारित करने के लिए सिद्धांत उपकरण बना रहता है, वहीं प्रोटीन की उच्च सांद्रता की जरूरत है और व्यापक अनुकूलन विवर्तन गुणवत्ता क्रिस्टल का उत्पादन करने के लिए आवश्यक है। इस तरह के मेम्ब्रेन-संबंधी और आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन के रूप में प्रोटीन, जो कि मणिभ के लिए मुश्किल हैं, प्रतिष्ठित हाइड्रोजन ड्यूटेरियम विनिमय (HDX) एनएमआर 5 से अध्ययन किया गया है। हालांकि, हाल के दशकों में, electrospray ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ईएसआई-एमएस) HDX के युग्मन तेजी से लोकप्रियता 6, 7 हासिल की है।
मास स्पेक्ट्रोमेट्री एक समाधान प्रदान करता हैएक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और एनएमआर से उत्पन्न प्रतिबंध के कई करने के लिए। विशेष रूप से, एमएस अत्यधिक संवेदनशील (माइक्रोन आवश्यक सांद्रता के एनएम), और प्रोटीन आकार पर कोई सीमा लगभग होती है। इसके अलावा, एमएस विश्लेषण के उच्च कर्तव्य चक्र प्रोटीन का अध्ययन कर के रूप में वे एंजाइमी कारोबार, misfolding, complexation और अन्य जैविक रूप से प्रासंगिक प्रक्रियाओं से गुजरना करने की संभावना के लिए अनुमति देता है। इन प्रक्रियाओं अक्सर दूसरी बार पैमाने पर करने के मिलीसेकंड पर पाए जाते हैं और विश्लेषण करने से पहले अभिकर्मकों का तेजी से मिश्रण की आवश्यकता है।
2003 की अनुमति दी प्रतिक्रियाओं में समय-समाधान किया electrospray ionization (TRESI) विल्सन और Konermann द्वारा के विकास ईएसआई-एमएस द्वारा छद्म वास्तविक समय में नजर रखी जा करने के लिए। उनके सेटअप एक लगातार समायोज्य प्रतिक्रिया चैम्बर मात्रा 8 के साथ एक केशिका मिक्सर शामिल किया। डिवाइस संकीर्ण अंतर-capillar भीतर मिश्रण के लिए अनुमति देने के लिए दो संकेंद्रित केशिकाओं, भीतरी केशिका सील और एक पायदान अपने पक्ष में कटौती के साथ होते हैंभीतरी केशिका (आमतौर पर 2 मिमी) के अंत तक निशान से y अंतरिक्ष। HDX प्रयोगों के लिए आवेदन किया है, भीतरी केशिका ब्याज की प्रोटीन वहन करती है, बाहरी केशिका लेबलिंग डी किया जाता है 2 हे समाधान है, जो तब प्रोटीन के साथ समायोज्य प्रतिक्रिया कक्ष HDX लेबलिंग के लिए अनुमति प्रवेश करने से पहले पूर्व सीधा हस्तांतरण करने के लिए ईएसआई में मिश्रण की प्रक्रिया स्रोत।
संक्षेप में, HDX रीढ़ एमाइड समाधान 9, 10 में ड्यूटेरियम परमाणुओं के साथ आदान-प्रदान के दौर से गुजर हाइड्रोजन पर निर्भर करता है। विनिमय आधार उत्प्रेरित शारीरिक पीएच पर, एसिड कटैलिसीस नीचे पीएच लगभग 2.6 में प्रचलित होता जा रहा है। पीएच, तापमान, विलायक पहुंच और इंट्रामोलीक्युलर हाइड्रोजन संबंध: विनिमय की दर चार मुख्य कारकों पर आधारित है। के रूप में पूर्व दो कारकों प्रयोग, विनिमय की दर, विशेष रूप से पेप्टाइड रीढ़ एमाइड स्थानों पर में स्थिर रखा जाता है, मुख्य रूप से dependen हैप्रोटीन संरचना 11 पर टी। कसकर α-हेलिक्स और β-शीट में व्यापक, स्थिर हाइड्रोजन संबंध नेटवर्क के साथ क्षेत्रों मुड़ा हुआ छोरों और अव्यवस्थित क्षेत्रों (और कभी कभी बिल्कुल नहीं) 12 की तुलना में काफी धीमी दर पर ड्यूटेरियम तक लगेंगे। यह वैश्विक प्रोटीन विश्लेषण, के लिए अनुमति देता है जहां संरचना में अव्यवस्थाएं (जैसे।, एकत्रीकरण या सब्सट्रेट बंधन पर) ड्यूटेरियम तेज (चित्रा 1) भिन्न करने के लिए नेतृत्व।
गतिज केशिका मिक्सर ड्यूटेरियम तेज के स्थानीयकरण के लिए एक प्रोटियोलिटिक चैम्बर युक्त एक microfluidic मंच में शामिल किया जा सकता है। यह प्रोटियोलिटिक कक्ष आदेश में प्रभावी रूप विनिमय प्रतिक्रिया बुझाने के लिए में कम पीएच में आयोजित, और आदेश स्थानीय पेप्टाइड्स (चित्रा 2) में प्रोटीन को पचाने में में एक स्थिर एसिड प्रोटीज की आवश्यकता है। दूसरी बार तराजू को मिलीसेकंड पर निगरानी रीढ़ आदान प्रदान के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैमुश्किल भीतर गठनात्मक परिवर्तन के लक्षण वर्णन पाश क्षेत्रों, पिघला हुआ ग्लोबुलेस और आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन (आईडीपी) 13, 14 चिह्नित करने के लिए। वैकल्पिक रूप से, TRESI-HDX भी प्रोटीन है कि वर्तमान में एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और एनएमआर के तरीकों के माध्यम से एक हल परमाणु संरचना की जरूरत नहीं है चिह्नित करने के लिए, COREX एल्गोरिथ्म (DX-COREX) दृष्टिकोण 15, 16 के लिए युग्मित ड्यूटेरियम विनिमय का उपयोग किया जा सकता है। इस विस्तृत प्रोटोकॉल, ताऊ, एक आईडीपी का अध्ययन करने में दोनों यह मूल रूप है और साथ ही यह रोगजनक hyperphosphorylated राज्य है TRESI-HDX लागू होगी। जबकि देशी ताऊ सबसे अच्छी तरह से अध्ययन विस्थापितों में से एक है, थोड़ा अपने amyloidogenic समकक्ष 13 के बारे में जाना जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
जबकि इस तरह के एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और एनएमआर के रूप में संरचनात्मक जीव विज्ञान के तरीकों फायदेमंद है क्योंकि वे प्रोटीन की अत्यंत विस्तृत संरचनाओं प्रदान कर रहे हैं, इन चित्रों को अक्सर स्थिर रहे…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge Dr. Markus Zweckstetter for providing the pdb coordinate file for the ‘native’ tau ensemble predicted from his NMR work, with contributed analysis tools provided by Dr. Adnan Sljoka. Funding for this work was provided by the Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC) ENGAGE Grant program.
Materials
| Poly(methyl methacrylate) or PMMA | Professional Plastics | SACR.250CCP | 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm |
| Fused Silica Glass Capillary | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID: 75µm, OD: 150µm |
| Metal Capillaries | McMaster-Carr | 28 ga – 89875K97 30 ga – 89875K99 |
|
| Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing | IDEX | 1477 1548 |
ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16” |
| Standard Polymer Tubing Cutter | IDEX | A-327 | for 1/16” and 1/8” OD tubing |
| Micro Static Mixing Tee | IDEX | M-540 | for 1/16” OD tubing |
| or | |||
| Stainless Steel Tee, 0.25mm Bore | Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | for 1/16” OD tubing |
| PEEK Tee for 1/16” OD Tubing | IDEX | P-727 | |
| 10-32 Female to Female Luer | IDEX | P-659 | |
| 10-32 PEEK Double-Winged Nut | IDEX | F-300 | |
| Ferrule for 1/16” OD Tubing | IDEX | F-142 | |
| 100 Series Rotary Tool | Dremel | F013010001 | |
| Cut-Off Discs | Jobmate | 1/64” thickness | |
| Stereomaster Digital Zoom Microscope | Fisher Scientific | 12-563-411 | |
| Soldering Iron | Mastercraft | 58-6301-2 | |
| VersaLaser | Universal Laser | ||
| Syringes | Hamilton | 81220 | 500µL capacity |
| Syringe Pumps | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NHS-Activated Agarose | Fisher Scientific | 26196 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
| Deuterium Oxide | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software/Online Tools | |||
| CorelDraw X3 | Corel | ||
| Molecular Weight Calculator | Version 6.49 | Open Source MS Tool | |
| mMass | Version 5.5.0 | Open Source MS Tool | |
| ExPASy FindPept | Swiss Institute of Bioinformatics | ||
| SigmaPlot | Systat Software | Version 11.0 | |
| PyMOL | Schrödinger | Version 1.5.0.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer | AB SCIEX |
References
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