Konforma flexibilitet spelar en avgörande roll i proteinfunktion. Häri beskriver vi användning av tidsupplöst elektrosprayjoniseringsmasspektrometri kopplad till väte-deuterium utbyte mot sondering de snabba strukturella förändringar som driver funktionen i ordnade och oordnade proteiner.
Egen oordnade proteiner (IDP) har länge varit en utmaning att strukturella biologer på grund av deras brist på stabila sekundära strukturelement. Väte-Deuterium Exchange (HDX) mätt vid snabba tidsskalor är unikt anpassad att detektera strukturer och vätebindningsnätverk som kortfattat är befolkade, vilket möjliggör karaktäriseringen av transienta konformer i nativa ensembler. Koppling av HDX för masspektrometri erbjuder flera viktiga fördelar, inklusive hög känslighet, låg provförbrukning och ingen begränsning på proteinstorleken. Denna teknik har avancerat kraftigt under de senaste årtiondena, inklusive möjligheten att övervaka HDX märkning gånger på millisekundtidsskalan. Dessutom genom att införliva den HDX arbetsflöde på en mikrofluidisk plattform inrymmer en sur proteas mikroreaktor, har vi möjlighet att lokalisera dynamiska egenskaper vid peptidnivån. I denna studie, Time-Resolved elektrosprayjoniseringsmasspektrometri (Tresi-MS) kopplad till HDX was som används för att ge en detaljerad bild av kvarvarande struktur i tau-protein, såväl som konforma skift inducerats vid hyperfosforylering.
Under de senaste årtiondena, har betydande framsteg gjorts i utvecklingen av analytiska tekniker utformade för att mäta proteinstruktur och dynamik 1, 2, 3, 4. Medan röntgenkristallografi förblir principen verktyg för att bestämma proteinstrukturen, är höga koncentrationer av protein som behövs och omfattande optimering krävs för att producera diffraktion kvalitetskristaller. Proteiner som är svåra att kristallisera, såsom membran-associerade och tätt oordnade proteiner har klassiskt studerats av väte-deuterium utbyte (HDX) NMR 5. Emellertid, under de senaste decennierna, koppling av elektrosprayjonisering masspektrometri (ESI-MS) till HDX har snabbt vunnit popularitet 6, 7.
Masspektrometri erbjuder en lösningtill många av de begränsningar som orsakas av röntgenkristallografi och NMR. I synnerhet, är MS högkänslig (nM till pM koncentrationer som erfordras), och det finns praktiskt taget ingen gräns för proteinstorlek. Dessutom kan den höga arbetscykeln för MS-analys ger en möjlighet att studera proteiner som de undergår enzymatisk omsättning, felveckning, komplexbildning och andra biologiskt relevanta processer. Dessa processer förekommer ofta på millisekund till andra tidsskala och kräver snabb blandning av reagens före analys.
Utvecklingen av tidsupplöst elektrosprayjonisering (Tresi) av Wilson och KONER i 2003 tillåtna reaktioner övervakas i pseudo-realtid genom ESI-MS. Sina inställningar inkorporerade ett kapillär bländare med en kontinuerligt justerbar reaktionskammarvolymen 8. Anordningen består av två koncentriska kapillärer, med den inre kapillären förseglades och en skåra skuren i dess sida för att medge för blandning inom det smala inter capillary utrymme från skåran till änden av den inre kapillären (typiskt 2 mm). När det appliceras på HDX experiment, den inre kapillären bär proteinet av intresse, bär den yttre kapillären märknings D 2 O lösningen, som därefter genomgår blandning med proteinet före inträdet i justerbara reaktionskammaren medger HDX märkning före direkt överföring in i ESI källa.
I korthet, HDX förlitar sig på ryggrads amid väten som genomgår utbyte med deuteriumatomer i lösning 9, 10. Utbytet är baskatalyserad vid fysiologiskt pH, med syra-katalys blir förhärskande vid pH under ca 2,6. Hastigheten för utbytet är baserat på fyra huvudfaktorer: pH, temperatur, lösningsmedelstillgänglighets och intramolekylär vätebindning. Som de tidigare två faktorer hålls konstanta genom hela experimentet, graden av utbyte, i synnerhet vid peptid ryggraden amid positioner, är i första hand dependent på proteinstrukturen 11. Tätt vikta regioner med omfattande, stabila vätebindande nät i a-spiraler och p-ark kommer att ta upp deuterium vid väsentligt lägre hastigheter jämfört med öglor och oordnade områden (och ibland inte alls) 12. Detta medger för global proteinanalys, där störningar i strukturen (t ex., Vid aggregation eller substratbindning) leder till olika deuterium-upptag (Figur 1).
Den kinetiska kapillär biandaren kan införlivas i en mikrofluidisk plattform innehållande proteolytisk kammare för lokalisering av deuterium upptag. Denna proteolytiska kammaren hålls vid lågt pH för att effektivt släcka utbytesreaktionen, och kräver en immobiliserad syra proteas för att smälta proteinet in lokaliserade peptider (Figur 2). Övervakning utbyte ryggraden vid millisekund till andra tidsskalor är särskilt viktigt förkarakterisering av konformationsförändringar inom svåra att karakterisera ögleregioner, smälta globuler, och inneboende oordnade proteiner (IDP) 13, 14. Alternativt kan Tresi-HDX också användas för att karaktärisera proteiner som för närvarande inte har en löst atomstruktur genom metoderna för röntgenkristallografi och NMR, med användning av deuterium utbyte kopplad till COREX algoritm (DX-COREX) tillvägagångssätt 15, 16. Denna detaljerade protokoll gäller Tresi-HDX att studera tau, en IDP, i både det ursprungliga form, liksom det är patogena hyperfosforylerat tillstånd. Även infödda tau är en av de mest studerade internflyktingar, lite är känt om dess amyloidogena motsvarighet 13.
Medan strukturbiologiska metoder såsom röntgenkristallografi och NMR är fördelaktiga eftersom de tillhandahåller extremt detaljerade strukturer av proteiner, dessa bilder är ofta statiska. Karakterisering av transienta arter och svagt strukturerade domäner fortsätter att vara svårfångade när studerats av dessa konventionella metoder. Därför är det för att få dynamiska insikter om dessa typer av system viktigt att arbeta vid snabba tidsskalor. Vi har framgångsrikt tillämpats Tresi-HDX-MS för att få de…
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge Dr. Markus Zweckstetter for providing the pdb coordinate file for the ‘native’ tau ensemble predicted from his NMR work, with contributed analysis tools provided by Dr. Adnan Sljoka. Funding for this work was provided by the Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC) ENGAGE Grant program.
Poly(methyl methacrylate) or PMMA | Professional Plastics | SACR.250CCP | 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm |
Fused Silica Glass Capillary | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID: 75µm, OD: 150µm |
Metal Capillaries | McMaster-Carr | 28 ga – 89875K97 30 ga – 89875K99 |
|
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing | IDEX | 1477 1548 |
ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16” |
Standard Polymer Tubing Cutter | IDEX | A-327 | for 1/16” and 1/8” OD tubing |
Micro Static Mixing Tee | IDEX | M-540 | for 1/16” OD tubing |
or | |||
Stainless Steel Tee, 0.25mm Bore | Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | for 1/16” OD tubing |
PEEK Tee for 1/16” OD Tubing | IDEX | P-727 | |
10-32 Female to Female Luer | IDEX | P-659 | |
10-32 PEEK Double-Winged Nut | IDEX | F-300 | |
Ferrule for 1/16” OD Tubing | IDEX | F-142 | |
100 Series Rotary Tool | Dremel | F013010001 | |
Cut-Off Discs | Jobmate | 1/64” thickness | |
Stereomaster Digital Zoom Microscope | Fisher Scientific | 12-563-411 | |
Soldering Iron | Mastercraft | 58-6301-2 | |
VersaLaser | Universal Laser | ||
Syringes | Hamilton | 81220 | 500µL capacity |
Syringe Pumps | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
NHS-Activated Agarose | Fisher Scientific | 26196 | |
Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
Deuterium Oxide | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-4 | |
Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
Sodium Phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S671-3 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software/Online Tools | |||
CorelDraw X3 | Corel | ||
Molecular Weight Calculator | Version 6.49 | Open Source MS Tool | |
mMass | Version 5.5.0 | Open Source MS Tool | |
ExPASy FindPept | Swiss Institute of Bioinformatics | ||
SigmaPlot | Systat Software | Version 11.0 | |
PyMOL | Schrödinger | Version 1.5.0.4 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Instruments | |||
QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer | AB SCIEX |