Summary

في المختبر و في فيفو التقييم تي وب وخلايا النقوي النشاط القمعية واستجابات خلطيه من المتلقين زرع

Published: August 12, 2017
doi:

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا للحث على التسامح في زرع الأعضاء، وتقييم في المختبر و في فيفو القدرة القمعية لمجموعات فرعية خلية متميزة من المتلقي وحالة المتلقي تجاه الجهات المانحة أو المستضدات خارجية المنشأ المناعي.

Abstract

مصدر القلق الرئيسي في زرع لتحقيق التسامح محددة من خلال تنظيم دورات تعريفية للخلايا التنظيمية. فهم آليات التسامح يتطلب نماذج موثوقة. وهنا يصف لنا نماذج التسامح إلى allograft القلب في الفئران، التي يسببها حصار إشارات كوستيموليشن أو upregulation من جزيئات إيمونوريجولاتوري من خلال نقل الجينات. كل من هذه النماذج يسمح في فيفو جيل من الخلايا التنظيمية مثل خلايا تي التنظيمية (تريجس)، والتنظيمية ب خلايا (برجس) أو خلايا النقوي التنظيمية (ريجمكس). في هذه المخطوطة، يمكننا وصف هذين البروتوكولين التكميلية التي استخدمت لتحديد وتعريف نشاط الخلية التنظيمية في المختبر و في فيفو لتحديد مسؤوليتهم في الحث على التسامح وصيانة. أولاً، في المختبر قمعية مقايسة يسمح التعرف السريع على الخلايا مع القدرات القمعية في الاستجابات المناعية المستجيب بطريقة تعتمد جرعة، ويمكن استخدامها لمزيد من التحليل مثل قياس سيتوكين أو سيتوتوكسيسيتي. ثانيا، التبني نقل الخلايا من مستلم تعامل متسامح إلى مستلم المطعمة حديثا المشع، أبرز خصائص هذه الخلايا في السيطرة على الاستجابات المناعية الاختلاس الموجهة و/أو تحويل (خلايا تنظيمية جديدة توليروجينيك وصف التسامح المعدية). هذه الأساليب لا تقتصر على الخلايا التي تحتوي على علامات المظهرية المعروفة، ويمكن تمديدها لأي سكان الخلية. وعلاوة على ذلك، توجه المانحين اللوسبيسيفيسيتي الخلايا التنظيمية (هدفا هاما في الميدان) يمكن تقييمها باستخدام خلايا المانحين طرف ثالث أو graft سواء في المختبر أو في الجسم الحي. وأخيراً، لتحديد قدرة توليروجينيك محددة من هذه الخلايا التنظيمية، نقدم بروتوكولات لتقييم استجابات خلطيه المانحة المضادة الأجسام المضادة وقدرة المتلقي على تطوير استجابات خلطيه ضد المستضدات المعروفة الجديدة أو السابقة. نماذج التسامح ووصف يمكن استخدامها لزيادة تميز الخلايا التنظيمية، وتحديد المؤشرات الحيوية الجديدة، وجزيئات إيمونوريجولاتوري، وهي قابلة للتكيف لزرع نماذج أخرى أو أمراض المناعة الذاتية في مكافحة القوارض أو البشرية.

Introduction

Allograft القلب في الفئران هو نموذج زرع جهاز يمكن الاعتماد عليها لتقييم العلاجات التعريفي التسامح، فك آليات التسامح التعريفي، والصيانة، ولديه القدرة على حمل الخلايا التنظيمية المختصة وظيفيا والمهيمنة. البروتوكولات التالية تصف تماما عدم تطابق هيتيروتوبيك القلب طعم من الفئران مانحة 1 وات لويس (LEW.1W، RT1u) في الفئران المستفيدة 1A لويس (LEW.1A، RT1). في هذا الجمع الاختلاس، الرفض الحاد يحدث سريعاً (في حوالي 7 أيام) ويمكن تقييمها بسهولة بالاختلاس الضرب القياس من خلال جس البطن. ونقترح هنا ثلاثة بروتوكولات للحث على التسامح إلى allograft القلب في الفئران. في هذه النماذج، التسامح هو فعل و/أو تحتفظ بها أنواع مختلفة من الخلايا التنظيمية. أولاً، بحظر CD40-CD40L التفاعلات مع إتش ترميز CD40Ig (AdCD40Ig) الناجمة عن توليد CD8+ تريجس قادرة على استحثاث التسامح عند أدوبتيفيلي ونقل إلى المستلمين المطعمة الثانوي1. وعلاوة على ذلك، نضوب CD8 الخلايا+ (مع الأجسام المضادة-CD8α) في AdCD40Ig تعامل المستلمين التي تم إنشاؤها برجس وريجمكس2. تحليل عميق ل CD8+ تريجس خصائص الضوء على الدور الرئيسي للعديد من الجزيئات immunoregulatory يعرف انترلوكين-34 (إيل-34) وفيبروليوكين-2 (فجل-2)3،،من45،6 . بينما overexpression إيل-34 (مع ناقل إف) الناجم عن تريجس من خلال جيل ريجمكس، overexpression فجل-2 التي يسببها برجس، التي تقوم عليها الشبكة المعقدة من الخلايا التنظيمية.

سبب الرفض المزمن يتطور ببطء وطويلة الأجل، مطلوب تحليلاً متعمقا للتمييز بين التسامح مقابل الرفض المزمن. عادة ما يتم تقييم الفساد لتسلل خلية، التليف، وسماكة الأوعية ترسب C4d الجدار وتكملة إيمونوهيستولوجي7. بينما تتطلب التضحية الحيوانية أساليب علم الأنسجة أو graft خزعة، هنا نحن تصف طريقة بسيطة لتقييم ميزات مختلفة من allograft التحمل: ظهور ووظيفة الخلايا التنظيمية واستجابات المانحين لمكافحة جسم معين من الدم عينة من التدفق الخلوي (هنا، استخدمنا خلية تنشيط fluorescence الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)).

الحفاظ على التسامح allograft بعد إلقاء القبض على المعاملة يرتبط عموما بتحريض الخلايا التنظيمية8. في العقود الماضية، ركزت الدراسات على CD4+تريجس تتميز الإجماع عليها بعلامات رئيسية Foxp3+CD25عاليةو CD1279،،من1011. وبالمثل، وعلامات عدة نسبت إلى CD8+ تريجس، مثل CD122+، CD28، CD45RCمنخفضة، PD1+، و Helios+ 1،12،،من1314 , 15 , 16 , 17-على مدى سنوات، تعبيراً عن جيتر و CTLA4 والسيتوكينات (إيل-10، 34 TGFβ، إيل، إيل-35، فجل-2) ارتبطت بالإضافة إلى ذلك أن تريغ الشخصية3،،من46،13، 18،19،،من2021. بيد أن السكان الخلية التنظيمية الناشئة، مثل برجس، أو ريجمكس، أو نكتريجس، تفتقر إلى علامات محددة ذات الصلة. والواقع أن معظمها سجلت بريجس ك CD24 غير ناضجة+ الخلايا، مع التعبير CD27 غامضة وأحيانا إنتاج إيل-10، TGFβ، أو جرانزيمي ب22،،من2324. تعقد سلالة خلية النقوي يتطلب مزيجاً من عدة علامات لتحديد التشكيل الجانبي التنظيمية أو proinflammatory مثل CD14، CD16، CD80، CD86، CD40، CD209a، أو CD163،من2526. وأخيراً، أبلغ بعض علامات التعرف على نكتريجس مثل CD11b+، CD27+, TGFβ+، ولكن المزيد من الدراسات ضرورية لزيادة وصف لهم فينوتيبيكالي27،28،29 ،30،،من3132. وهكذا، أدلة على نشاط القمعية مطلوبة لإضفاء الشرعية على مزيد من الوصف المظهرية لتحديد المؤشرات الحيوية الجديدة، جديدة immunoregulatory الوسطاء، وتوسيع النطاق إلى علاجات جديدة في الخلية.

ونحن نقترح طريقتين مكملة لتقييم نشاط الخلايا القمعية. أولاً، الأسلوب في المختبر يتكون من استزراع الخلايا القمعية مع خلايا المستجيب المسمى تي تحفزها مستضد متمكنة من المانحين تقديم الخلايا (Apc) في نسب مختلفة على مدى 6 أيام، وتحليل المستجيب T الخلية الانتشار التي ويعكس قمع المناعة الموجه من الجهات المانحة. ويمكن مقارنة الخلايا من الفئران المعالجة مباشرة إلى الخلايا من السذاجة الجرذان والفئران المطعمة غير المعالجة لنشاط القمعية (أو لأي سكان الخلية التنظيمية الأخرى)، في طائفة من نسب القامع: المستجيب. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب لا يتطلب أي الزرع، ويتم الحصول على النتائج خلال 6 أيام. ثانيا، الأسلوب في فيفو يتكون من نقل الخلايا التنظيمية المقصود من الفئران معالجة إلى مستلم المطعمة حديثا المشع. بينما الخلايا أو الخلايا النقوي تي ب الخلايا من الفئران غير المعالجة من السذاجة عادة غير قادر على تمنع الرفض الحاد وإطالة أمد بقاء الفساد عند نقل التبني، والخلايا ذات النشاط القمعية potentiated من متلقي العلاج هذه السمات 1،،من23،،من433. ينصح ليمفوبينيا الناجمة عن الإشعاع المتلقي للسماح للخلايا المنقولة أدوبتيفيلي لتظل غير متأثرة بالتوازن الدم وإتقان أكثر سهولة من الاستجابات المناعية المضادة الجهات المانحة. لكلتا الطريقتين، الاستخدام في المختبر لأنه طرف ثالث ناقلات الجنود المدرعة أو في فيفو المتبنيين نقل القمعية الخلايا إلى المستلمين المطعمة بقلب الطرف الثالث يسمح بتحليل لخصوصية المانحين المضادة. بينما الأسلوب في فيفو يتطلب عدد كبير من الخلايا، وسوء تمثيل يمكن تقييم الفئات السكانية الفرعية الخلية بسهولة أكبر لنشاط القمعية في المختبر33.

ويمكن أيضا قياس استجابات خلطيه لتقييم حالة التسامح والسيطرة على استجابات الأجسام المضادة الموجهة إلى الجهات المانحة المستضدات. وفي الواقع، يمكن وصف التسامح بعدم استجابة خلطيه تجاه المانحين ولكن المحافظة على قدرة للمستلمين لتطوير استجابة خلطيه لمولدات جديدة والحفاظ على الذاكرة الردود. أولاً، مبدأ الكشف اللوانتيبودي يستند على الاعتراف بالخلايا المانحة المستفيدة الأجسام المضادة بعد الحضانة لنوع الخلية المانحة مع المصل من مستلم المطعمة. الثاني، خلطيه والاستجابات الموجهة إلى المستضدات خارجية المنشأ يمكن تحفيز التالية المقررة المستلمين متسامح طويلة الأجل مع ثقب المفتاح مفج هيموسيانين (كله) مستحلب مع adjuvant الشعبية فروند كاملة. وجود الأجسام المضادة IgM و IgG محددة ضد المستضدات يمكن الكشف عن 4 و 13 يوما، على التوالي، عقب التمنيع، بمقايسة الممتز الإنزيم المرتبط (أليسا)34. ثالثا، يمكن تقييم الحفاظ على الذاكرة المناعية الردود عن طريق الحقن إكسينوجينيك خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) في أيام-7 و + 3 للزرع وكرات الدم الحمراء تلطيخ مع المصل المتلقية التي تم جمعها في أيام + 8 و + 17 بعد زرع الأعضاء. كل هذه الأساليب تسمح للتعرف على أنواع فرعية الغلوبولين المناعي باستخدام أجسام مضادة ثانوية محددة، وسرعة الحصول على النتائج في أقل من 1.5 ح بنظام مراقبة الأصول الميدانية تلطيخ أو بضع ساعات قبل أليسا.

وأخيراً، هذه البروتوكولات المصممة من أجل توصيف لزرع نماذج، ويمكن أن تكون، إلى حد ما، تنطبق على نماذج أمراض المناعة الذاتية. يمكن أن تنقل مبادئ الأسلوب لجميع الأنواع.

Protocol

ملاحظة: جميع البروتوكولات هنا أقرتها لجنة أخلاقية دولية، وينبغي أن يجري بطريقة عقيمة. 1. جيل التسامح في نموذج Allograft القلب في الفئران LEW.1W إلى LEW.1A allograft الداخلي تخدير الذكور مانحة LEW.1W الفئران استخدام استنشاق isoflurane-س2 ، وتستكمل مع % 1 ن2س بعد دقيقة …

Representative Results

تقييم نشاط القمعية بعد فرز ناقلات الجنود المدرعة (الشكل 1)، وخلايا المستجيب وتريجس في أن واحد (الشكل 2)، أو بشكل فردي (الشكل 4)، ويمكن أن يكون أي المفترضة التنظيمية الخلايا الأخرى (الشكل 3)، القيام به في فيفو<…

Discussion

نقل التبني من مجموع سبلينوسيتيس إلى مستلم المطعمة حديثا طريقة فعالة للكشف عن وجود خلايا تنظيمية المستحث أو بوتينتياتيد بعلاج. المضيف التي يسببها الإشعاع ليمفوبينيا عابرة يعزز بقاء الخلية بعد نقل وإقامة للتسامح. وعلاوة على ذلك، يترك تشعيع الفتاكة دون وقت للخلايا مع خصائص توليروجينيك لتح?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد أدركت هذا العمل في سياق المشروع مكتب المفتش العام لابيكس (جوان ANR-11-لابكس-0016-01) الذي يعد جزءا من برنامج الحكومة الفرنسية “يشرف دعفينير” الذي يديره ANR (ANR-11-لابكس-0016-01) ومشروع رامي سيستي تمول أيضا من خلال ” يشرف دعفينير “برنامج” الحكومة الفرنسية “، تتم إدارته من قبل الفرنسية الوطنية أبحاث الوكالة (ANR-10-إيبهو-005). رامي-سيستي المشروع تدعمه أيضا نانت متروبول وضمور يدفع de la Loire.

Materials

animals
LEW.1W and LEW.1A rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
BN third party donor rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
name company catalogue number comments
reagents
AdCD40Ig Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
IL34-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
FGL2-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
anti-TCR Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K R7/3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD25 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX39 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD8 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX8 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RA Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX33 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD161 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K 3.2.3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD11b/c Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX42 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-TCRgd Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K V65 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RC Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX22 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD4 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX35 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45R BD Biosciences, Mountain View, CA #554881, His24 clone
anti-rat IgG-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #112-096-071
anti-rat IgG1 Serotec #MCA 194
anti-rat IgG2a Serotec #MCA 278
anti-rat IgG2b Serotec #MCA 195
anti-rat IgM-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #115-095-164
streptavidin HRP BD Biosciences, Mountain View, CA #554066
KLH Sigma Aldrich, St. Louis, USA #9013-72-3
PBS 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, 
Tween 20 Sigma, Saint-Louis, USA #9005-64-5
TMB substrate reagent kit BD Biosciences, Mountain View, CA #555214
CellTraceTM CFSE cell proliferation kit Thermo Fisher Scientific Inc, USA #C34554
RPMI 1640 medium 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA #31870-025
penicilline streptomycine Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15140-122
Hepes Buffer Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15630-056
non essential amino acids Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11140-035
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11360-039
2 beta mercaptoethanol Sigma, Saint-Louis, USA #M3148
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell Thermo Fisher Scientific Inc, USA #65-0842-85
Glutamine Sigma, Saint-Louis, USA #G3126
DAPI Thermo Fisher Scientific Inc, USA #D1306
Collagenase D Roche Diagnostics, Germany #11088882001
EDTA Sigma, Saint-Louis, USA #E5134
NaCl 0.9% Fresenius Kabi #B230561
Magnetic dynabeads Dynal, Invitrogen #11033 Goat anti-mouse IgG
One Comp eBeads Ebiosciences, San Diego, USA #01-1111-42
Betadine Refer to the institutional guidelines
Isoflurane Refer to the institutional guidelines
Naplbuphine Refer to the institutional guidelines
Terramycine Refer to the institutional guidelines
Buprenorphine Refer to the institutional guidelines
Meloxicam Refer to the institutional guidelines
Complete Freund's adjuvant
Rompun Refer to the institutional guidelines
Ringer lactate Refer to the institutional guidelines
Ketamine Refer to the institutional guidelines
Red blood cell lysis solution Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O.
Collagenase D Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS
PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%) Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen) Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution
complete medium for coculture 500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS
name company catalog number comments
equipments
falcon 50ml BD Biosciences, Mountain View, CA #227261
falcon 15ml BD Biosciences, Mountain View, CA #188271
sieve
Corning plastic culture dishes VWR, Pessac #391-0439
100µm and 60µm tissue filters Sefar NITEX, Heiden, Switzerland #03-100/44 and #03-60/35
96 wells U bottom plates for coculture  Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning #353077
96 wells V bottom plates for FACS staining ThermoScientifique, Danemark #249570
96 wells flat bottom ELISA plates Nunc Maxisorb
seringue for spleen crush BD Biosciences, Mountain View, CA #309649
ELISA reader SPARK 10M, Tecan, Switzerland SPARK 10M, Tecan, Switzerland
centrifuge
bain marie 
X rays irradiator Lincolshire, England Faxitron CP160
solar agitator
FACS Canto II BD Biosciences, Mountain View, CA
FACS Aria II BD Biosciences, Mountain View, CA
magnet Thermo Fisher Scientific Inc, USA 12302D

References

  1. Guillonneau, C., et al. CD40Ig treatment results in allograft acceptance mediated by CD8CD45RC T cells, IFN-gamma, and indoleamine 2,3-dioxygenase. J Clin Invest. 117 (4), 1096-1106 (2007).
  2. Bézie, S., et al. Compensatory Regulatory Networks between CD8 T, B, and Myeloid Cells in Organ Transplantation Tolerance. J Immunol. 195 (12), 5805-5815 (2015).
  3. Bézie, S., et al. Fibrinogen-Like Protein 2/Fibroleukin Induces Long-Term Allograft Survival in a Rat Model through Regulatory B Cells. PloS One. 10 (3), e0119686 (2015).
  4. Bézie, S., et al. IL-34 is a Treg-specific cytokine and mediates transplant tolerance. J Clin Invest. 125 (10), 3952-3964 (2015).
  5. Li, X. L., et al. Mechanism and localization of CD8 regulatory T cells in a heart transplant model of tolerance. J Immunol. 185 (2), 823-833 (2010).
  6. Guillonneau, C., Bézie, S., Anegon, I. Immunoregulatory properties of the cytokine IL-34. Cell Mol Life Sci. , (2017).
  7. Nickeleit, V., Zeiler, M., Gudat, F., Thiel, G., Mihatsch, M. J. Detection of the complement degradation product C4d in renal allografts: diagnostic and therapeutic implications. J Am Soc Nephrol. 13 (1), 242-251 (2002).
  8. Chiffoleau, E., et al. Induction of donor-specific allograft tolerance by short-term treatment with LF15-0195 after transplantation. Evidence for a direct effect on T-cell differentiation. Am J Transplant. 2 (8), 745-757 (2002).
  9. Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nat Immunol. 4 (4), 337-342 (2003).
  10. Liu, W., et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. J Exp Med. 203 (7), 1701-1711 (2006).
  11. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).
  12. Dai, Z., et al. Natural CD8+CD122+ T cells are more potent in suppression of allograft rejection than CD4+CD25+ regulatory T cells. Am J Transplant. 14 (1), 39-48 (2014).
  13. Guillonneau, C., Picarda, E., Anegon, I. CD8+ regulatory T cells in solid organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 15 (6), 751-756 (2010).
  14. Kim, H. J., et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 350 (6258), 334-339 (2015).
  15. Manavalan, J. S., et al. Alloantigen specific CD8+CD28- FOXP3+ T suppressor cells induce ILT3+ ILT4+ tolerogenic endothelial cells, inhibiting alloreactivity. Int Immunol. 16 (8), 1055-1068 (2004).
  16. Picarda, E., et al. Transient antibody targeting of CD45RC induces transplant tolerance and potent antigen-specific regulatory T cells. JCI Insight. 2 (3), e90088 (2017).
  17. Ménoret, S., et al. Phenotypic and functional characterization of CD8(+) T regulatory cells. Methods Mol Biol. 677, 63-83 (2011).
  18. Boor, P. P. C., et al. Human plasmacytoid dendritic cells induce CD8+ LAG-3+ Foxp3+ CTLA-4+ regulatory T cells that suppress allo-reactive memory T cells. Eur J Immunol. 41 (6), 1663-1674 (2011).
  19. Olson, B. M., Sullivan, J. A., Burlingham, W. J. Interleukin 35: a key mediator of suppression and the propagation of infectious tolerance. Front Immunol. 4, 315 (2013).
  20. Shimizu, J., Yamazaki, S., Takahashi, T., Ishida, Y., Sakaguchi, S. Stimulation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance. Nat Immunol. 3 (2), 135-142 (2002).
  21. Myers, L., Croft, M., Kwon, B. S., Mittler, R. S., Vella, A. T. Peptide-specific CD8 T regulatory cells use IFN-gamma to elaborate TGF-beta-based suppression. J Immunol. 174 (12), 7625-7632 (2005).
  22. Bouaziz, J. D., Le Buanec, H., Saussine, A., Bensussan, A., Bagot, M. IL-10 producing regulatory B cells in mice and humans: state of the art. Curr Mol Med. 12 (5), 519-527 (2012).
  23. Durand, J., Chiffoleau, E. B cells with regulatory properties in transplantation tolerance. World J Transplant. 5 (4), 196-208 (2015).
  24. Pallier, A., et al. Patients with drug-free long-term graft function display increased numbers of peripheral B cells with a memory and inhibitory phenotype. Kidney Int. 78 (5), 503-513 (2010).
  25. Guillonneau, C. Efficacy of Myeloid Derived Suppressor Cells on Transplant Survival. Transplantation. 99 (10), 2017-2019 (2015).
  26. Wood, K. J., Bushell, A., Hester, J. Regulatory immune cells in transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 417-430 (2012).
  27. Han, Y., et al. Pathogen-expanded CD11b+ invariant NKT cells feedback inhibit T cell proliferation via membrane-bound TGF-β1. J Autoimmun. 58, 21-35 (2015).
  28. Mesnard, L., et al. Invariant natural killer T cells and TGF-beta attenuate anti-GBM glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 20 (6), 1282-1292 (2009).
  29. Mi, Q. S., Ly, D., Zucker, P., McGarry, M., Delovitch, T. L. Interleukin-4 but not interleukin-10 protects against spontaneous and recurrent type 1 diabetes by activated CD1d-restricted invariant natural killer T-cells. Diabetes. 53 (5), 1303-1310 (2004).
  30. Sharif, S., et al. Activation of natural killer T cells by alpha-galactosylceramide treatment prevents the onset and recurrence of autoimmune Type 1 diabetes. Nat Med. 7 (9), 1057-1062 (2001).
  31. Wermeling, F., Lind, S. M., Jordö, E. D., Cardell, S. L., Karlsson, M. C. I. Invariant NKT cells limit activation of autoreactive CD1d-positive B cells. J Exp Med. 207 (5), 943-952 (2010).
  32. Yang, S. H., et al. Sulfatide-reactive natural killer T cells abrogate ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 22 (7), 1305-1314 (2011).
  33. Picarda, E., et al. MHC-derived allopeptide activates TCR-biased CD8+ Tregs and suppresses organ rejection. J Clin Invest. 124 (6), 2497-2512 (2014).
  34. Guillot, C., et al. Prolonged blockade of CD40-CD40 ligand interactions by gene transfer of CD40Ig results in long-term heart allograft survival and donor-specific hyporesponsiveness, but does not prevent chronic rejection. J Immunol. 168 (4), 1600-1609 (2002).
  35. Guillonneau, C., et al. Inhibition of chronic rejection and development of tolerogenic T cells after ICOS-ICOSL and CD40-CD40L co-stimulation blockade. Transplantation. 80 (4), 546-554 (2005).
  36. Guillonneau, C., et al. Anti-CD28 antibodies modify regulatory mechanisms and reinforce tolerance in CD40Ig-treated heart allograft recipients. J Immunol. 179 (12), 8164-8171 (2007).
  37. Qin, S., et al. "Infectious" transplantation tolerance. Science. 259 (5097), 974-977 (1993).
  38. Picarda, &. #. 2. 0. 1. ;., Ossart, J., Bézie, S., Guillonneau, C. Key role of allopeptide-specific CD8(+) Tregs in transplantation. Médecine Sci (Paris). 31 (1), 22-24 (2015).
  39. Chevalier, S., Lacroix, H., Moreau, J. F., Soulillou, J. P. Blood transfusion plus allograft–but not blood transfusion alone–induce IL 2-producing suppressor cells in Lew-1A recipients of LEW-1W heart allograft. Transplant Proc. 19 (1 Pt 1), 544-546 (1987).
  40. Fang, C., et al. Autoimmune responses against renal tissue proteins in long-term surviving allograft recipients. Transpl Int. 22 (11), 1091-1099 (2009).
  41. Yang, C. P., Bell, E. B. Persisting alloantigen prevents primed CD45RC- CD4 T cells from inducing allograft rejection: implications for immunological memory. Eur J Immunol. 29 (7), 2177-2186 (1999).
  42. Durand, J., et al. Regulatory B Cells with a Partial Defect in CD40 Signaling and Overexpressing Granzyme B Transfer Allograft Tolerance in Rodents. J Immunol. 195 (10), 5035-5044 (2015).
  43. Iwata, Y., et al. Characterization of a rare IL-10-competent B-cell subset in humans that parallels mouse regulatory B10 cells. Blood. 117 (2), 530-541 (2011).
  44. Newell, K. A., et al. Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).
  45. Sagoo, P., et al. Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).
  46. Guillonneau, C., David, L., Anegon, I. Improved Analyses of CD8+ T Cell Specificities Using Multimers of Peptide MHC Complexes Coupled to DNA Barcodes. Transplantation. 101 (2), 219-221 (2017).
check_url/55510?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Bézie, S., Usal, C., Guillonneau, C. In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients. J. Vis. Exp. (126), e55510, doi:10.3791/55510 (2017).

View Video