La détection de G Protein-Coupled Receptor Internalisation activé de ligand par microscopie confocale
Summary
Ce protocole décrit la détection de la microscopie confocale de l'internalisation du récepteur (GPCR) couplé à la protéine G dans les cellules de mammifères. Il comprend la culture de cellules de base, la transfection et la procédure de microscopie confocale et fournit une méthode efficace et facilement interprétable pour détecter la localisation subcellulaire et intériorisation des GPCR de fusion exprimée.
Abstract
Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.
Introduction
Les cellules possèdent la machinerie de trafic de fret pour le transport extracellulaire matériaux tels que des ligands, des micro – organismes, des substances nutritives et des protéines transmembranaires dans la cellule pour obtenir des informations, de l' énergie, et d' autres buts 1, 2. Il est essentiel pour l'homéostasie cellulaire, la fonction des tissus, et la survie globale des cellules. L'expression à base de cellules de protéines de fusion fluorescentes est un moyen puissant pour étudier la localisation et l' internalisation des récepteurs transmembranaires, telles que G récepteurs couplés aux protéines (RCPG), dans les voies de signalisation 3.
L'expression des protéines de fusion composées de la protéine fluorescente verte (GFP) de méduse Aequorea victoria, combinée avec des techniques de détection de fluorescence directe, a acquis une large acceptation dans la recherche de ciblage de protéine 4, 5, 6. detecti à base de GFPle a l'avantage de permettre l'imagerie en temps réel des cellules vivantes tout en évitant les artefacts de fixation 7. Une série de vecteurs de clonage polyvalents a été construit pour faciliter l'expression des fusions de protéines de la GFP dans les diverses cellules 8, 9. Le vecteur pEGFP-N1 est un vecteur plasmidique commercialisé largement utilisé et codant pour une protéine fluorescente verte améliorée (EGFP), qui a été optimisée de la GFP de type sauvage pour la fluorescence plus brillante et une expression plus élevée dans les cellules de mammifères. Pour observer le signal fluorescent de l'EGFP exprimée dans des cellules de mammifères, la microscopie de fluorescence doit être effectuée avec l'excitation à 488 nm et l'émission à 507 nm, de préférence avec la microscopie confocale.
Le suivi de la localisation subcellulaire et l' internalisation à médiation par un ligand de récepteurs est une technique courante pour étudier la transduction du signal et la fonction des GPCR 10 </sup>, 11. Dans la plupart des cas, l' internalisation conduit à une désensibilisation des GPCR (l'atténuation de la réponse du stimulus , en dépit de la présence d'agonistes) 12, 13. Les récepteurs intériorisées peuvent être incorporés dans les lysosomes et dégradés, ou ils peuvent être recyclés à la surface cellulaire, en fonction de la nature des récepteurs et des lignées cellulaires utilisées dans les expériences.
Les récepteurs de l' hormone de libération des gonadotrophines (GnRHRs) appartiennent à la famille GPCR et ont une structure de protéine de GPCR typique, avec un amino – terminale extracellulaire, un terminal -COOH intracellulaire, et sept transmembranaire (TM) 14 domaines. La transfection du plasmide recombinant Sj GnRHR-EGFP (avec le gène GnRHR de Sepiella japonica) et la détection de la microscopie confocale de Sj EGFP-tagged GnRHR (exprimée dans des cellules HEK293) ont été signalés Previously, et la fluorescence de la GFP a été établi en tant que rapporteur pour les tests de localisation de la protéine transmembranaire 15. Maintenant, l'intériorisation de Sj GnRHR, activé par S. japonica hormone de libération de gonadotrophine (GnRH Sj), a été démontrée dans les manières fonction du temps et de la dose par microscopie confocale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté ici fournit une méthode efficace et facilement interprétable pour détecter la localisation subcellulaire et intériorisation de protéines de fusion GPCR exprimé dans les cellules HEK293. La technique peut être facilement adapté pour de nombreux gènes différents et types de cellules, par exemple pour la localisation cellulaire et de l' internalisation du récepteur corazonin de Bombyx mori dans des cellules HEK293 et BMN 16.
<p class="jove_content"…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors of this paper would like to thank Prof. Jiayan Xie for technical assistance and equipment usage. This work was financially supported by the National Natural Science Foundation of China (41406137).
Materials
| HEK293 cell line | |||
| DMEM/High glucose | Hyclone | SH30022.01 | High glucose 4.0 mM L-glutamine |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | PuFei | 1101-100 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genom | GNM10010 | |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% Trypsin & 0.02% EDTA | Genom | GNM25200 | |
| Opti-MEM (1X) | GIBCO, by Life Technologies | 31985-062 | reduced serum media |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | Reagent 1 |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | Reagent 2 |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0126 | |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) | 80096618 | |
| 100 mm cell culture | CORNING | 430167 | |
| 6-well plate | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| 12-well plate | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| Cover Glass | NEST | 801007 | |
| Microscope Slides | Citoglas | 10127105P-G | |
| Thermo Scientific Forma CO2 Incubator | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II laser scanning confocal microscope | Leica | 5100001311 |
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