Rilevamento di Ligand-activated proteina G-recettore accoppiato internalizzazione da microscopia confocale
Summary
Questo protocollo descrive rilevamento microscopia confocale del recettore accoppiato alla proteina G (GPCR) internalizzazione in cellule di mammifero. Esso comprende la coltura di cellule di base, trasfezione, e la procedura microscopia confocale e fornisce un metodo efficiente e facilmente interpretabili per rilevare la localizzazione subcellulare e internalizzazione del GPCR fusione espressa.
Abstract
Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.
Introduction
Cellule possiedono macchine traffico merci da trasportare extracellulare materiali, ad esempio leganti, microrganismi, nutrienti e proteine transmembrana-nella cella per informazioni, energia e altri scopi 1, 2. È fondamentale per l'omeostasi cellulare, la funzione dei tessuti, e la sopravvivenza delle cellule complessiva. L'espressione a base di cellule di proteine di fusione fluorescenti è un potente strumento per studiare la localizzazione e internalizzazione di recettori transmembrana, come G recettori accoppiati alle proteine (GPCR), in vie di segnalazione 3.
L'espressione di proteine di fusione contrassegnate con proteina fluorescente verde (GFP) dalla medusa Aequorea victoria, combinato con tecniche di rivelazione di fluorescenza diretta, ha guadagnato un largo consenso nel proteina-targeting di ricerca 4, 5, 6. detecti GFP-basedsulla presenta il vantaggio di consentire l'imaging in tempo reale delle cellule viventi evitando artefatti fissaggio 7. Una serie di vettori di clonaggio versatili è stato costruito per facilitare l'espressione di proteine per fusioni GFP in varie cellule 8, 9. Il vettore pEGFP-N1 è un vettore plasmidico utilizzato e commercializzato codificante una maggiore proteina fluorescente verde (EGFP), che è stato ottimizzato da wild-type per GFP luminosa fluorescenza e più alta espressione in cellule di mammifero. Per osservare il segnale fluorescente EGFP espresso in cellule di mammifero, la microscopia a fluorescenza deve essere condotta con l'eccitazione a 488 nm e l'emissione a 507 nm, preferibilmente con microscopia confocale.
Monitoraggio della localizzazione subcellulare e internalizzazione ligando mediata da recettori è una tecnica comune per indagare la trasduzione del segnale e funzione della GPCR 10 </sup>, 11. Nella maggior parte dei casi, porta alla internalizzazione desensibilizzazione dei GPCR (l'attenuazione della risposta stimolo nonostante la presenza di agonisti) 12, 13. I recettori internalizzati possono essere incorporati nella lisosoma e degradati, oppure possono essere riciclati alla superficie cellulare, a seconda della natura dei recettori e le linee cellulari utilizzate negli esperimenti.
I recettori dell'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRHRs) appartengono alla famiglia GPCR e hanno una struttura tipica proteina GPCR, con un terminale ammino extracellulare, un terminale -COOH intracellulare, e sette transmembrana (TM) 14 domini. La trasfezione di plasmidico ricombinante Sj GnRHR-EGFP (con il gene GnRHR da Sepiella japonica) e la rilevazione di microscopia confocale GnRHR Sj EGFP-tag (espressi in cellule HEK293) è stata riportata Precemalizioso, e la fluorescenza GFP è stato stabilito come reporter per saggi di localizzazione della proteina transmembrana 15. Ora, l'interiorizzazione di Sj GnRHR, attivato da S. japonica gonadotropina-releasing hormone (GnRH Sj), è stata dimostrata in maniere tempo-e dose-dipendenti mediante microscopia confocale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo presentato qui offre un metodo efficiente e facilmente interpretabili per rilevare la localizzazione subcellulare e l'interiorizzazione della proteina di fusione GPCR espresso in cellule HEK293. La tecnica può essere facilmente adattato per molti geni differenti e tipi di cellule, come per la localizzazione cellulare e internalizzazione del recettore corazonin da Bombyx mori in cellule HEK293 e Bmn 16.
L'applicazione di successo di ques…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors of this paper would like to thank Prof. Jiayan Xie for technical assistance and equipment usage. This work was financially supported by the National Natural Science Foundation of China (41406137).
Materials
| HEK293 cell line | |||
| DMEM/High glucose | Hyclone | SH30022.01 | High glucose 4.0 mM L-glutamine |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | PuFei | 1101-100 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genom | GNM10010 | |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% Trypsin & 0.02% EDTA | Genom | GNM25200 | |
| Opti-MEM (1X) | GIBCO, by Life Technologies | 31985-062 | reduced serum media |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | Reagent 1 |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | Reagent 2 |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0126 | |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) | 80096618 | |
| 100 mm cell culture | CORNING | 430167 | |
| 6-well plate | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| 12-well plate | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| Cover Glass | NEST | 801007 | |
| Microscope Slides | Citoglas | 10127105P-G | |
| Thermo Scientific Forma CO2 Incubator | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II laser scanning confocal microscope | Leica | 5100001311 |
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