Påvisning av ligand-aktiverte G-protein-koblet reseptor Internalisering ved hjelp av konfokal mikroskopi

Summary

Denne protokollen beskriver konfokal mikroskopi påvisning av G-protein-koblet reseptor (GPCR) internalisering i pattedyrceller. Den inneholder den grunnleggende cellekultur, transfeksjon, og konfokal mikroskopi og fremgangsmåte tilveiebringer en effektiv og lett tolkbar metode for å påvise subcellulære lokalisering og internalisering av fusjons uttrykt GPCR.

Abstract

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

Introduction

Celler som har last trafikkmaskiner for transport av ekstracellulære materialer, for eksempel ligander, mikroorganismer, næringsstoffer og transmembranproteiner-inn i cellen for å få informasjon, energi, og andre formål ^{1, 2.} Det er viktig for cellulær homeostase, vev funksjon, og total celleoverlevelse. Den cellebaserte ekspresjon av fluorescerende fusjonsproteiner er en effektiv måte å studere lokalisering og internalisering av transmembranreseptorer, slik som G-protein-koblede reseptorer (GPCR), i signaliseringsveier ^3.

Ekspresjon av fusjonsproteinene kodet med grønt fluorescerende protein (GFP) fra maneter Aequorea Victoria, kombinert med direkte fluorescens-deteksjonsteknikker, har fått bred aksept i protein-målsøkende forskning ^{4, 5, 6.} GFP-baserte detectividere har den fordel at den tillater sanntids avbildning av levende celler mens man unngår fikseringsartifakter ^7. En rekke allsidige kloningsvektorer er konstruert for å lette ekspresjonen av proteinfusjoner til GFP i forskjellige celler ^{8, 9.} Den pEGFP-N1-vektoren er en utbredt og kommersialisert plasmid-vektor som koder for en forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP), som har blitt optimalisert fra villtype-GFP for lysere fluorescens og høyere ekspresjon i pattedyrceller. For å observere det fluorescente signalet av EGFP uttrykt i pattedyrceller, bør den fluorescens mikroskopi utføres med eksitasjon ved 488 nm og emisjon ved 507 nm, fortrinnsvis med konfokal mikroskopi.

Overvåking av subcellulære lokalisering og ligand-mediert internalisering av reseptorene er en vanlig teknikk for å undersøke signaloverføring og funksjon av GPCR ¹⁰ </s^{opp>, 11.} I de fleste tilfeller fører til internalisering desensibilisering av GPCR (dempningen av stimulus respons på tross av nærvær av agonister) ^{12, 13.} De internalisert reseptorene kan bli innlemmet i lysosomet og brytes ned, eller de kan resirkuleres tilbake til celleoverflaten, avhengig av naturen av reseptorene og cellelinjene anvendt i eksperimentene.

De gonadotropinfrigjørende hormon-reseptorer (GnRHRs) tilhører den GPCR familien og har en typisk GPCR proteinstruktur, med et ekstracellulært aminoterminal, en intracellulær -COOH terminal, og syv transmembran (TM) domener ^14. Den transfeksjon av rekombinant plasmid Sj GnRHR-EGFP (med GnRHR genet fra Sepiella japonica) og den konfokal mikroskopi påvisning av EGFP-merket Sj GnRHR (uttrykt i HEK293 celler) ble rapportert previouslu, og GFP fluorescens ble etablert som en reporter for transmembranprotein lokaliserings analyser ^15. Nå, internalisering av Sj GnRHR, aktivert av S. japonica gonadotropin-frigjørende hormon (GnRH Sj), ble demonstrert i tids- og doseavhengig oppførsel ved hjelp av konfokal mikroskopi.

Protocol

1. Cellefremstilling Cell utvinning Overfør kryokonserverte humane embryoniske nyre 293 (HEK293) celler fra en flytende nitrogentanken til et 37 ° C vannbad, og det hele rystes kontinuerlig i 1 – 2 min. Tilsett 10 ml ekvilibrert vekstmedium (Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), 10% føtalt bovint serum (FBS), og 1% penicillin-streptomycin-løsning) til en 10-cm cellekulturskål. Tilsett den opptinte celler til den ekvilibrerte vekstmediet. Cellene inkuber…

Representative Results

Figur 1 viser et eksempel på et system konfokalt mikroskop. Figur 2 viser ekspresjon av pEGFP-N1 i HEK293-celler. GFP signal ble detektert i cytoplasma og cellekjernen. Figur 3 viser subcellulære lokalisering av GnRHR fra S. japonica i HEK293 celler, i tråd med våre tidligere publiserte resultater 15. Fusjonsproteinet med EGFP-koden i den C-terminale ende av Sj GnRHR (Sj GnRHR-EGFP) …

Discussion

Protokollen som presenteres her tilveiebringer en effektiv og lett tolkbar metode for å påvise subcellulære lokalisering og internalisering av uttrykt GPCR fusjonsprotein i HEK293-celler. Teknikken kan lett tilpasses til mange forskjellige gener og celletyper, slik som for cellulær lokalisering og internalisering av den corazonin reseptoren fra Bombyx mori i HEK293 og BMN celler ^16.

Vellykket bruk av dette kraftige analysen bygger på noen viktige faktore…

Materials

HEK293 cell line
DMEM/High glucose	Hyclone	SH30022.01	High glucose 4.0 mM L-glutamine
Foetal Bovine Serum (FBS)	PuFei	1101-100
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Genom	GNM10010
Penicillin-Streptomycin	Genom	GNM15140
0.25% Trypsin & 0.02% EDTA	Genom	GNM25200
Opti-MEM (1X)	GIBCO, by Life Technologies	31985-062	reduced serum media
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668027	Reagent 1
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent	Roche	6366236001	Reagent 2
DAPI Staining Solution	Beyotime	C1006
DiI	Beyotime	C1036
Antifade Mounting Medium	Beyotime	P0126
Paraformaldehyde	Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC)	80096618
100 mm cell culture	CORNING	430167
6-well plate	ExCell Bio	CS016-0092
12-well plate	ExCell Bio	CS016-0093
Cover Glass	NEST	801007
Microscope Slides	Citoglas	10127105P-G
Thermo Scientific Forma CO2 Incubator	Thermo	3111
TCS SP5II laser scanning confocal microscope	Leica	5100001311