Detektering av ligand-aktiverade G-proteinkopplade receptorer Interna genom konfokalmikroskopi
Summary
Detta protokoll beskriver konfokalmikroskopi detektering av G-proteinkopplade receptorer (GPCR) internalisering i däggdjursceller. Den innefattar den grundläggande cellkultur, transfektion, och konfokal mikroskopi förfarandet och tillhandahåller ett effektivt och enkelt tolkningsbara metod att detektera den subcellulära lokaliseringen och internalisering av fusions-uttryckt GPCR.
Abstract
Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.
Introduction
Celler har last trafficking maskiner för att transportera extracellulära material-sådana som ligander, mikroorganismer, näringsämnen och transmembranproteiner-in i cellen efter information, energi, och andra ändamål 1, 2. Det är avgörande för cellulär homeostas, vävnadsfunktion och övergripande cellöverlevnad. Den cellbaserade expression av fluorescerande fusionsproteiner är ett kraftfullt sätt att studera lokaliseringen och internalisering av transmembranreceptorer, såsom G-proteinkopplade receptorer (GPCR), i signalvägar 3.
Uttrycket av fusionsproteiner märkta med grönt fluorescerande protein (GFP) från maneten Aequorea Victoria, i kombination med direkt fluorescensdetektionstekniker, har vunnit stor acceptans i protein-måls forskning 4, 5, 6. GFP-baserade detectipå har fördelen att tillåta realtids avbildning av levande celler och samtidigt undvika fixerings artefakter 7. En serie mångsidiga kloningsvektorer har konstruerats för att underlätta uttrycket av proteinfusioner till GFP i olika celler 8, 9. Den pEGFP-N1-vektor är en allmänt använd och kommersialiserat plasmidvektor som kodar en förstärkt grönt fluorescerande protein (EGFP), som har optimerats från vildtyps-GFP för ljusare fluorescens och högre uttryck i däggdjursceller. Att observera den fluorescerande signalen hos EGFP uttryckt i däggdjursceller bör fluorescensmikroskopi utföras med excitation vid 488 nm och emission vid 507 nm, företrädesvis med konfokalmikroskopi.
Övervaka den subcellulära lokaliseringen och ligand-medierad internalisering av receptorer är en vanlig teknik för att undersöka signalomvandling och funktionen av GPCR 10 </supp> 11. I de flesta fall leder interna till desensibilisering av GPCR (dämpningen av stimulus respons trots närvaro av agonister) 12, 13. De internaliserade receptorer kan införlivas i lysosomen och bryts ned, eller de kan återvinnas tillbaka till cellytan, beroende på naturen av receptorerna och de cellinjer som användes i experimenten.
De gonadotropin-frisättande hormonreceptorer (GnRHRs) hör till den GPCR familjen och har en typisk GPCR proteinstruktur, med en extracellulär aminoterminal, en intracellulär -COOH terminal, och sju transmembran (TM) domäner 14. Transfektion av rekombinanta plasmiden Sj GnRHR-EGFP (med GnRHR-genen från Sepiella japonica) och konfokal mikroskopi detektion av EGFP-märkt Sj GnRHR (uttryckt i HEK293-celler) rapporterades previously, och GFP-fluorescens var etablerad som en reporter för transmembranproteinlokaliseringsanalyser 15. Nu, internaliseringen av Sj GnRHR, aktiverad av S. japonica gonadotropinfrisättande hormon (Sj GnRH), visades i tids- och dosberoende sätt genom konfokalmikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det protokoll som presenteras här ger en effektiv och lätt tolkningsbar metod att detektera den subcellulära lokaliseringen och internalisering av uttryckt GPCR-fusionsprotein i HEK293-celler. Tekniken kan lätt anpassas för många olika gener och celltyper, såsom för den cellulära lokaliseringen och internalisering av corazonin receptor från Bombyx mori i HEK293 och BMN cellerna 16.
En framgångsrik tillämpning av denna kraftfulla analys bygger på …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors of this paper would like to thank Prof. Jiayan Xie for technical assistance and equipment usage. This work was financially supported by the National Natural Science Foundation of China (41406137).
Materials
| HEK293 cell line | |||
| DMEM/High glucose | Hyclone | SH30022.01 | High glucose 4.0 mM L-glutamine |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | PuFei | 1101-100 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genom | GNM10010 | |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% Trypsin & 0.02% EDTA | Genom | GNM25200 | |
| Opti-MEM (1X) | GIBCO, by Life Technologies | 31985-062 | reduced serum media |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | Reagent 1 |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | Reagent 2 |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0126 | |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) | 80096618 | |
| 100 mm cell culture | CORNING | 430167 | |
| 6-well plate | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| 12-well plate | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| Cover Glass | NEST | 801007 | |
| Microscope Slides | Citoglas | 10127105P-G | |
| Thermo Scientific Forma CO2 Incubator | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II laser scanning confocal microscope | Leica | 5100001311 |
References
- Mellman, I. Endocytosis and molecular sorting. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 575-625 (1996).
- Hausott, B., Klimaschewski, L. Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons. Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).
- Kallal, L., Benovic, J. L. Using green fluorescent proteins to study G-protein-coupled receptor localization and trafficking. Trends Pharmacol Sci. 21, 175-180 (2000).
- Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111, 229-233 (1992).
- Spector, D. L., Goldman, R. D. Constructing and Expressing GFP Fusion Proteins. CSH protocols. 2006, (2006).
- Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli. FEBS Lett. 507, 220-224 (2001).
- von Arnim, A. G., Deng, X. W., Stacey, M. G. Cloning vectors for the expression of green fluorescent protein fusion proteins in transgenic plants. Gene. 221, 35-43 (1998).
- Webb, C. D., Decatur, A., Teleman, A., Losick, R. Use of green fluorescent protein for visualization of cell-specific gene expression and subcellular protein localization during sporulation in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 177, 5906-5911 (1995).
- Kain, S. R., et al. Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization. BioTechniques. 19, 650-655 (1995).
- Fukunaga, S., Setoguchi, S., Hirasawa, A., Tsujimoto, G. Monitoring ligand-mediated internalization of G protein-coupled receptor as a novel pharmacological approach. Life Sci. 80, 17-23 (2006).
- Yang, J., et al. Agonist-Activated Bombyx Corazonin Receptor Is Internalized via an Arrestin-Dependent and Clathrin-Independent Pathway. Biochemistry. 55, 3874-3887 (2016).
- Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. Regulation of G protein-coupled receptor kinases and arrestins during receptor desensitization. Mol Pharmacol. 63, 9-18 (2003).
- Ferguson, S. S., et al. Role of beta-arrestin in mediating agonist-promoted G protein-coupled receptor internalization. Science. 271, 363-366 (1996).
- Stojilkovic, S. S., Reinhart, J., Catt, K. J. Gonadotropin-releasing hormone receptors: structure and signal transduction pathways. Endocr Rev. 15, 462-499 (1994).
- Yan, Y. J., et al. Identification and Expression Profile of the Gonadotropin-Releasing Hormone Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. , (2016).
- Yang, J., et al. Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling cascades. J Biol Chem. 288, 11662-11675 (2013).
- Lu, Z. M., et al. Cloning, Characterization, and Expression Profile of Estrogen Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 325, 181-193 (2016).
