共焦点顕微鏡により、リガンド活性化Gタンパク質共役型受容体内在化の検出
Summary
このプロトコルは、哺乳動物細胞におけるGタンパク質共役受容体（GPCR）内在化の共焦点顕微鏡検出を記載します。これは、基本的な細胞培養、トランスフェクション、および共焦点顕微鏡手順を含み、融合発現GPCRの細胞内局在および内在化を検出するための効率的かつ容易に解釈可能な方法を提供します。
Abstract
Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.
Introduction
細胞は、情報、エネルギー、及び他の目的の1、2についての細胞内タンパク質、細胞外物質、例えばリガンド、微生物、栄養素、および膜貫通などを輸送する貨物輸送の機構を有します。それは、細胞の恒常性、組織機能、および全体的な細胞の生存に重要です。蛍光融合タンパク質の細胞ベースの発現は、経路3シグナリングに、そのようなGタンパク質共役受容体（GPCR）のような膜貫通受容体の局在化および内在化を研究するための強力な方法です。
直接蛍光検出技術と組み合わせクラゲオワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（GFP）でタグ付けされた融合タンパク質の発現は、タンパク質-ターゲティング研究4、5、6で広く受け入れられています。 GFPベースdetecti固定アーティファクト7を回避しながら、生細胞のリアルタイムイメージングを可能にするという利点を有します。汎用性のクローニングベクター一連の種々の細胞8,9にGFPにタンパク質融合物の発現を促進するように構成されています。 pEGFP-N1ベクターは、哺乳動物細胞におけるより明るい蛍光およびより高い発現のために、野生型GFPから最適化された増強された緑色蛍光タンパク質（EGFP）をコードして広く使用され、市販されているプラスミドベクターです。 EGFPの蛍光シグナルは、哺乳動物細胞において発現を観察するために、蛍光顕微鏡は、好ましくは、共焦点顕微鏡では、488 nmでの励起および507 nmでの発光を用いて行われるべきです。
受容体の細胞内局在、およびリガンド媒介性内在化を監視することのGPCR 10のシグナル伝達および機能を調査する一般的な技術であります</s11、>アップ。ほとんどの場合、内在化は、GPCRの脱感作（アゴニストの存在にもかかわらず、刺激応答の減衰）12、13を導きます。内在化受容体は、リソソームおよび劣化に組み込むことができ、またはそれらは、受容体との実験で使用した細胞株の性質に応じて、細胞表面に再循環させることができます。
ゴナドトロピン放出ホルモン受容体（GnRHRs）はGPCRファミリーに属し、細胞外アミノ末端を有する典型的なGPCRタンパク質構造、細胞内-COOH端子、7つの膜貫通（TM）14ドメインを有します。 （SepiellaジャポニカからGnRHR遺伝子を有する）組換えプラスミドのSJ GnRHR-EGFPのトランスフェクションおよび（HEK293細胞に発現）EGFPタグのSJ GnRHRの共焦点顕微鏡検出をpreviouを報告しました。SLY、そしてGFP蛍光は、膜貫通タンパク質の局在化アッセイ15のためのレポーターとして設立されました。今、S.ジャポニカゴナドトロピン放出ホルモン（SjとのGnRH）によって活性化さSjの GnRHRの内部移行は、共焦点顕微鏡によって時間および用量依存的様式で実証されました。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで提示されたプロトコルは、HEK293細胞で発現GPCR融合タンパク質の細胞内局在および内在化を検出するための効率的かつ容易に解釈可能な方法を提供します。技術は容易にそのようなHEK293及びBMNセル16におけるカイコからcorazonin受容体の細胞局在及び内在化用として、多数の異なる遺伝子および細胞タイプに適合させることができます。
この?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors of this paper would like to thank Prof. Jiayan Xie for technical assistance and equipment usage. This work was financially supported by the National Natural Science Foundation of China (41406137).
Materials
| HEK293 cell line | |||
| DMEM/High glucose | Hyclone | SH30022.01 | High glucose 4.0 mM L-glutamine |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | PuFei | 1101-100 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genom | GNM10010 | |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% Trypsin & 0.02% EDTA | Genom | GNM25200 | |
| Opti-MEM (1X) | GIBCO, by Life Technologies | 31985-062 | reduced serum media |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | Reagent 1 |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | Reagent 2 |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0126 | |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) | 80096618 | |
| 100 mm cell culture | CORNING | 430167 | |
| 6-well plate | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| 12-well plate | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| Cover Glass | NEST | 801007 | |
| Microscope Slides | Citoglas | 10127105P-G | |
| Thermo Scientific Forma CO2 Incubator | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II laser scanning confocal microscope | Leica | 5100001311 |
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