Teknikker for å indusere og kvantifisere Cellular Senescence

Summary

Cellular senescens, den irreversible tilstand av cellesyklus-stans, kan induseres ved hjelp av forskjellige cellespenninger. Her beskriver vi protokollene for å indusere celle alderdom og metoder for å vurdere markører for begynnende alderdom.

Abstract

Som svar på cellulært stress eller skade, kan prolifererende celler induserer et bestemt program som starter en tilstand av langvarig celle-syklus arrest, kalt mobilnettet senescence. Akkumulering av aldrende celler som oppstår med organisme aldring og gjennom kontinuerlig dyrking in vitro. Aldrende celler påvirke mange biologiske prosesser, inkludert embryonisk utvikling, vevsreparasjon og regenerering, som svulsthemmer, og aldring. Kjennetegnene ved senescent celler omfatter, men er ikke begrenset til, øket begynnende alderdom-assosiert β-galaktosidase-aktivitet (SA-β-gal); p16 ^INK4A, p53 og p21 nivåer; høyere nivåer av DNA-skade, inkludert γ-H2AX; dannelsen av Senescence-assosiert Heterokromatin Foci (SAHF); og anskaffelse av en Senescence-assosiert Sekretorisk Fenotype (SASP), et fenomen karakterisert ved sekresjon av et antall av pro-inflammatoriske cytokiner og signaliseringsmolekyler. Her beskriver vi protokollene for både replicative ogDNA-skade indusert cellealdring i dyrkede celler. I tillegg har vi fremheve teknikker for å overvåke senescent fenotypen ved hjelp av flere aldrings-assosierte markører, inkludert SA-β-gal, γ-H2AX og SAHF flekker, og for å kvantifisere protein og mRNA-nivåer av cellesyklus regulatorer og SASP faktorer. Disse metodene kan brukes til vurdering av cellealdring i ulike modeller og vev.

Introduction

Over et halvt århundre siden, Hayflick og kolleger beskrev hvordan untransformed celler sprer i kultur, men for bare en begrenset periode ^1. Langsiktig dyrking av humane fibroblaster forårsaket cellene for å stoppe voksende; men de var metabolsk aktiv, og dette ble kalt mobilnettet senescence. Senescens kan være fordelaktig for å hemme tumorgenese, men det kan også være skadelig, da det er antatt å bidra til tap av evne til reproduksjon som oppstår med aldring ^{2, 3.} Senescent-celler er vist å akkumuleres i vev som mennesker alder ⁴ og har vært implisert i et utall biologiske prosesser, inkludert embryonisk utvikling, leging av sår, vevsreparasjon, og aldersrelatert inflammasjon ^2.

Kontinuerlig passering av celler i kultur induserer replikative senescens, som har vært knyttettil telomerer avgang og genomisk ustabilitet. Forskjellige cellespenninger, inkludert DNA-skade og onkogener, kan også føre til begynnende alderdom ^3. Senescens forårsaket av andre enn telomere slitasjefaktorene er ofte kalt stress-fremkalt eller viser for tidlig senescens og avhenger generelt av p16 ^INK4A / Rb sti ^5. Selv om formerende, ikke-transformerte celler vanligvis vises spindel i formen, kan aldrende celler bli identifisert som å ha visse egenskaper, herunder en flat, stort morfologi og øket begynnende alderdom-assosiert β-galaktosidase-aktivitet (SA-β-gal) (figurene 1 og 2). Aldrende celler også samle opp DNA-skade-markører, inkludert γ-H2AX (figur 3) ^{til 6,} og eventuelt begynnende alderdom-assosiert heterochromatin foci (SAHF) (figur 4) ^7. Aldrende celler har høyere nivåer av cellesyklusregulerende midler, inkludert p- 16 (p16 ^INK4A) og / eller p21 og p53 (figur 5) ^{8, 9.} Dessuten har nyere data vist at aldrende celler kan ha ikke-autonome effekter ved å skille et antall av pro-inflammatoriske cytokiner og kjemokiner som kalles den begynnende alderdom-assosiert sekretorisk fenotype (SASP) ^10. Selv om dette fenomen SASP kan variere fra celletype til celletype, generelt, er det vist ved en økning i Interleukin-6 (IL-6), IL-8, granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF), vekst- regulert onkogen α (GRO-α), og GRO-β, blant andre (figur 6). Den spesielle stress eller skade som induserer senescens kan også påvirke sekretorisk fenotype ^{11, 12, 13.} SASP kan påvises ved å måle nivåene av utskilte proteiner ved anvendelse av ELISA-er eller cytokin / protein-arrayers = "ekstern referanse"> ^{10, 14.} Selv om post-transkripsjonelle mekanismer kan regulere SASP proteinnivåene ^{11, 15, 16, 17,} endringer i mRNA-nivåer kan også bli detektert i mange tilfeller. Disse endringene er generelt mer sensitiv og lettere å kvantifisere protein enn nivåmålinger. Andre senescent markører kan også bli vurdert, inkludert vedvarende DNA-skade foci, som kalles DNA-segmenter med kromatin endringer armerings senescens (DNA-SCARS) ^18, og forskjellige andre markører ^{3, 19, 20.}

Her beskriver vi vanlige teknikkene for indusering av cellealdring på celler i kultur, og også for å måle flere markører av senescens, inkludert SA-β-Gal, γ-H2AX, SAHF, og protein og mRNA fra senescence-assosierte molekyler.

Protocol

1. Inducing replikativ Senescence Tine lav-passasje humane diploide fibroblaster (f.eks, WI-38 og IMR-90) eller andre cellelinjer. MERK: Her er humane diploide fibroblaster ble anvendt, men disse protokollene kan bli anvendt for å vurdere cellealdring på andre celletyper, slik som endotel, epitel, eller stamceller. Dyrkingsbetingelsene kan bli optimalisert for forskjellige celletyper som brukes på grunn av forskjellige vekstrater eller vekstbetingelser. MERK: Cellene må være prolif…

Representative Results

Figurene 2 – 6 viser representative resultater fra SA-β-gal-farging; farging for γ-H2AX og SAHF; Vurderingen av protein nivåer av p16 INK4A, p21 og p53; og mRNA og proteinnivåene av senescent-assosierte molekyler. Økt SA-β-gal-farving forekommer med replikativ og DNA-skade indusert cellealdring. Også observere de morfologiske endringene som skjer med begynnende alderdom. Celler blir forstørret og flat i forhold til spindelen utseende prolifererende fib…

Discussion

Her har vi beskrevet fremgangsmåter for replikativ og DNA-skade indusert cellealdring med humane diploide fibroblaster. I tillegg er teknikker for kvantifisering av protein og mRNA-nivåer av forskjellige aldrings-assosierte proteiner inkludert, i tillegg til farging for SA-β-gal og for DNA-skade markør γ-H2AX. Disse protokollene kan bli mye brukt til å vurdere senescent fenotyper både in vitro og in vivo, selv om mange begrensninger eksisterer for å karakterisere senescens in vivo <sup…

Materials

16% Tris-glycine gels	Invitrogen	XP00160BOX
Acid-Phenol ChCl3	Ambion	AM9720
Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibody	Invitrogen	A11031	1:300 dilution
Cell lifters	Corning Inc.	3008	Cell scraper
ECL anti-mouse HRP linked antibody	Amersham	NA931V
ECL Plus Western Blotting Substrate	Pierce	32132	ECL
DAPI	Molecular Probes	MP01306	stock 5 mg/ml in dH2O
GAPDH antibody	Santa Cruz	sc-32233	1:1,000-5,000 dilution
GlycoBlue	Ambion	AM9515
Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibody	Abcam	1220	1:500 dilution
Human IL-6 Quantikine ELISA assay	R&D systems	D6050
Human IL-8 Quantikine ELISA assay	R&D systems	D8000C
Human GROa Quantikine ELISA assay	R&D systems	DRG00
N-N-dimethylformamide	Sigma	D4551	DMF
p16 monoclonal antibody	BD Biosciences	51-1325gr	1:500 dilution
p21 monoclonal antibody	Millipore	05-345	1:750 dilution
p53 monoclonal antibody	Santa Cruz	sc-126	1:500 dilution clone DO-1
phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody	Cell Signaling	9719	1:2000 dilution
POWER SYBR-green PCR master mix	Applied Biosystems	4367659
Pre-stained molecular weight markers	Biorad	161-0374
ProLong Gold Antifade	Invitrogen	P36930
PVDF membrane	Thermo Scientific	88518
Senescence b-Galactosidase Staining Kit	Cell Signaling	9860
TRIzol	Ambion/Life Tech	10296028